李永麗，陳冬梅，徐 仙，馬會明

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)最早是從人的骨髓中分離、培養(yǎng)獲得，由于免疫原性較低，使MSCs成為組織工程的種子細(xì)胞之一[1-2]。胎盤來源的 MSCs (pMSCs)是從胎兒蛻膜側(cè)胎盤分離而來，屬于早期來源、有更高的傳代和分化能力的細(xì)胞，具有更高的擴(kuò)增能力[3-4]。由于其來源廣、免疫原性低、病毒污染率較低、不存在倫理爭議等優(yōu)點(diǎn)，目前pMSCs已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的一個(gè)非常具有吸引力的替代細(xì)胞。血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)是體內(nèi)重要的促血管生長因子，是pMSCs分泌蛋白組的成分之一[5]。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的卵巢局部移植對于治療化療所致的卵巢早衰有明顯的治療作用，治療效果可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌VEGF、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等有關(guān)[6]。我們的前期研究顯示[7],胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌許多細(xì)胞因子，改善卵巢局部微環(huán)境，使B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(BCL-2)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。為進(jìn)一步闡明人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)卵巢早衰的治療機(jī)制，本研究將人胎盤來源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液與卵巢早衰皮質(zhì)片共培養(yǎng)，以觀察VEGF對化療導(dǎo)致的受損卵巢的BCL-2蛋白的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料：Trizonl試劑，SYBR試劑，DMEM-LG，胎牛血清，TCM199ELISA 檢測試劑盒(美國，R&D公司)，Transwell，BCL-2單克隆抗體,免疫組化檢測試劑盒,ECL化學(xué)發(fā)光試劑和X線膠片。

1.2 方法

1.2.1 卵巢早衰大鼠模型建立及半卵巢體外培養(yǎng)：卵巢早衰大鼠模型建立方法[8]，取出早衰大鼠卵巢組織，用PBS反復(fù)沖洗3次，切除髓質(zhì)，僅保留皮質(zhì)；快速將皮質(zhì)切割成1 mm×5 mm×5 mm大小，隨機(jī)分為2組，每組各5塊用于共培養(yǎng)前后實(shí)驗(yàn)，置于卵巢培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素、10%胎牛血清(FBS)的TCM 199中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 模型大鼠半卵巢與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)：人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，分離并純化、用流式細(xì)胞儀鑒定后獲得的細(xì)胞，接種至含10% FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第1、第3、第4、第5和第6天無菌收集培養(yǎng)液，收集的培養(yǎng)液分別與半卵巢培養(yǎng)液按照1∶1混合培養(yǎng)(混合培養(yǎng)基)。將已準(zhǔn)備的半卵巢放置在transwell的上層，上述細(xì)胞接種在下層，用混合培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。

1.2.3 Real-time PCR檢測BCL-2和Bax mRNA的表達(dá)：收集的新鮮半卵巢及培養(yǎng)后的半卵巢，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。所用的引物是BCL-2，上游引物：3′-CCTGGCATCTTCTCCTTCCA-5′；下游引物為：3′-AGCGACGAGAGAAGTCATCC-5′； Bax：3′-CGAGTGTCTCAGGCGAATTG -5′；3′-ACACGGAAGA AGACCTCTCG-5′；反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR擴(kuò)增體系(25 μl),2×PCR buffer 12.5 μl，EXTaqHS 0.5 μl，EnzymeMi 0.5 μl，primer 1 0.5 μl，primer 2 0.5 μl，RNase free dH2O 7.5 μl;擴(kuò)增條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄2 min,95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 ELISA 檢測胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF分泌水平：胎盤干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF水平檢測， 收集新鮮卵巢皮質(zhì)片體外共培養(yǎng)前后細(xì)胞培養(yǎng)上清液， 對照組為共培養(yǎng)前細(xì)胞培養(yǎng)上清液，實(shí)驗(yàn)組為共培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)上清液；每組6個(gè)復(fù)孔，按ELISA試劑盒說明書方法操作，在 450 nm 波長測量各孔的吸光度(OD 值)，檢測VEGF水平。

1.2.5 培養(yǎng)后卵巢免疫組化檢測Bcl- 2的表達(dá)：操作步驟參照試劑盒說明及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序進(jìn)行，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化及抗原修復(fù)1-2 min；滴加H2O2孵育15 min；PBS沖洗3次，每次2 min；滴加羊抗兔 BCL-2單克隆抗體 (1∶200，博士德)，放入濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加新鮮配制的DAB工作液 (1∶100)，顯色5～10 min；洗去 DAB，顯微鏡下觀察；蘇木素襯染10 min，常規(guī)梯度乙醇脫水后封片。以 PBS替代一抗和二抗作為陰性對照。BCL-2 陽性結(jié)果判斷：陽性細(xì)胞著色定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜，呈棕黃色。

1.2.6 Western blot檢測半卵巢蛋白表達(dá)：Westert blot操作步驟按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序，提取卵巢皮質(zhì)片總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗BCL-2 和Bax(稀釋比例為1∶200)4 ℃孵育過夜；TBST室溫洗滌3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶6 000)，室溫下孵育1 h；TBST室溫洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線膠片曝光，顯影，定影。用Image lab軟件測定分析各條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參照(BCL-2蛋白相對表達(dá)=目的蛋白/β-actin)。

2 結(jié)果

2.1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及表面分子標(biāo)記CD90鑒定：經(jīng)過分離純化的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，多為長梭形，排列緊密；細(xì)胞胞漿豐富，核仁明顯，呈平行排列或漩渦樣生長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞。 傳代細(xì)胞生長旺盛，增殖迅速，培養(yǎng)細(xì)胞可穩(wěn)定生長傳代，傳至10代后，生長速度才逐漸減慢。經(jīng)過流式細(xì)胞儀對純化細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD90鑒定后,細(xì)胞純化有效率為99.4%,見圖1(目錄后)。

2.2 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液VEGF分泌檢測：胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間(6、12、24、36、48、60和72 h)的上清液中VEGF分泌水平用ELISA檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)6與12 h分泌水平相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，VEGF分泌水平逐漸增加，與培養(yǎng)24 h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)60 h以后可能達(dá)到分泌的平臺期，與70 h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 因此，以下實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)24 h 和培養(yǎng)60 h的培養(yǎng)液作為受試對象。

2.3 共培養(yǎng)前后卵巢的BCL-2基因表達(dá)Real-time PCR檢測：Real-time PCR檢測BCL-2基因在共培養(yǎng)前后卵巢中的相對表達(dá)結(jié)果顯示，與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)60 h的卵巢中BCL-2基因相對表達(dá)水平較對照組有顯著性升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 共培養(yǎng)前后卵巢的免疫組化BCL-2蛋白表達(dá)檢測：BCL-2在共培養(yǎng)前后卵巢表面上皮細(xì)胞、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、固縮壞死的卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞都有不同程度的的黃色染色，顯微鏡下這些細(xì)胞呈黃色或棕黃色，且胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后BCL-2染色逐漸增強(qiáng)。共培養(yǎng)前染色明顯低于其他組；對照組能見到較強(qiáng)的染色，且明顯高于其他各實(shí)驗(yàn)組，PBS代替一抗的未見特異性顯色,見圖2(目錄后)。

2.5 共培養(yǎng)前后卵巢的Western blot檢測：Western blotting檢測BCL-2蛋白在卵巢中的相對表達(dá)結(jié)果顯示，與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的卵巢中BCL-2蛋白相對表達(dá)水平較共培養(yǎng)前 (對照組)有顯著性升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

MSCs的重要生物學(xué)特性包括貼壁生長旺盛的成纖維樣呈梭形的細(xì)胞。本研究從人成熟胎盤中提取出了貼壁細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)、生長特性等方面符合干細(xì)胞的特點(diǎn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的卵巢局部移植對于治療化療所致的卵巢早衰有明顯的治療作用，治療效果可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌VEGF、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等的抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]，治療后大鼠卵巢各級卵泡數(shù)顯著增加，雌二醇濃度明顯上升，促卵泡激素濃度明顯下降，表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能修復(fù)卵巢結(jié)構(gòu)，改善卵巢內(nèi)分泌功能。

在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，本研究選擇了胎盤來源的MSCs進(jìn)行培養(yǎng)，以便更好地在臨床中開展細(xì)胞替代治療。研究中培養(yǎng)的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的VEGF量，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增加，在24 h時(shí)細(xì)胞由潛伏期開始向指數(shù)增生期過度，或者已經(jīng)達(dá)到指數(shù)增生期，分泌的VEGF水平已經(jīng)開始有顯著性增加。在培養(yǎng)到60 h時(shí)，上清中分泌的VEGF水平和培養(yǎng)至70 h時(shí)沒有顯著性區(qū)別，這一結(jié)果可能是因?yàn)樘ケP間充質(zhì)干細(xì)胞生長旺盛，迅速增殖的原因，細(xì)胞生長達(dá)到了生長平臺期，有可能已經(jīng)處于增殖抑制階段，或細(xì)胞已經(jīng)開始凋亡。因此研究中收集24和60 h 2個(gè)時(shí)間段的上清液體，對卵巢早衰的卵巢組織繼續(xù)培養(yǎng)。本研究利用提取的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌因子VEGF的作用，觀察能否為受損卵巢組織提供抗凋亡的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果。由凋亡相關(guān)基因調(diào)控的共同作用，根據(jù)細(xì)胞出現(xiàn)不同功能，可分為凋亡促進(jìn)基因，如Fas基因、Bax基因、半胱天冬酶-3(Caspase-3 )和Caspase-8 等，以及凋亡抑制基因，如BCL-2 和survivin基因等。 近年來研究表明[1]，顆粒細(xì)胞的凋亡決定于BCL家族、Caspase家族和Apaf-1三大類基因表達(dá)產(chǎn)物的相互平衡作用，其中Bcl家族成員的構(gòu)成比例是調(diào)控凋亡的核心機(jī)制之一，這一家族的2個(gè)代表性成員BCL-2和Bax是目前公認(rèn)的哺乳動物凋亡過程的正負(fù)調(diào)控劑。BCL-2 基因位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上，通過有效抑制不同類型細(xì)胞中許多不同類型的凋亡刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞活力而發(fā)揮其生物學(xué)作用，對細(xì)胞周期的進(jìn)程不發(fā)生影響[2]。這說明它在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制中起著十分重要的作用，可能是許多因子作用的共同分子基礎(chǔ)。

本研究中免疫組化結(jié)果顯示，BCL-2在與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后BCL-2染色逐漸增強(qiáng)。BCL-2基因表達(dá)蛋白通過對抗引起線粒體破裂的離子失衡，從而抑制細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子的釋放而抑制多種組織細(xì)胞(包括卵巢顆粒細(xì)胞)的凋亡和延長細(xì)胞壽命[11]。BCL-2在與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)后染色逐漸增強(qiáng)表明，BCL-2增量的表達(dá)可能修復(fù)了受損的卵巢顆粒細(xì)胞，從而修復(fù)了化療后的卵巢組織及功能的損傷。BCL-2存在于線粒體外膜,其表達(dá)可競爭性地與Bax蛋白結(jié)合,形成比Bax-Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bax-BCL-2異源二聚體,從而中和Bax-Bax誘導(dǎo)凋亡的作用,而終止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。即BCL-2與Bax可形成同源二聚體，也可相互作用形成異源二聚體，以決定是否接受凋亡信號或凋亡抑制信號，從而抑制細(xì)胞凋亡[12]。

Western blot結(jié)果表明，共培養(yǎng)后卵巢組織中BCL-2蛋白相對表達(dá)在共培養(yǎng)到60 h 時(shí)達(dá)到高峰。這與前面分泌的VEGF因子的表達(dá)時(shí)間是一致的。分泌的VEGF可能通過上調(diào)促凋亡的BCL-2的基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以影響凋亡的發(fā)生。VEGF抑制次級卵泡和囊狀卵泡凋亡，促進(jìn)血管生成,阻止生長卵泡過度耗竭，最終改善卵泡的發(fā)育[13]。本研究僅檢測了共培養(yǎng)時(shí)的VEGF的變化，這種共培養(yǎng)的狀態(tài)是否會影響其他調(diào)控因子或凋亡信號通路的調(diào)控，將進(jìn)一步在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)行。

綜上所述，BCL-2是研究卵巢早衰凋亡調(diào)控基因之一，BCL-2蛋白可顯著抑制顆粒細(xì)胞凋亡，參與卵巢細(xì)胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控。VEGF可能通過上調(diào)促凋亡的BCL-2的基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以影響凋亡的發(fā)生，這種作用亦表現(xiàn)出了明顯的時(shí)效性且有平臺效應(yīng)。環(huán)磷酰胺引起的大鼠卵巢損傷，可能通過干細(xì)胞移植可以修復(fù)POF卵巢功能[14]。