石玉祥，趙文鵬，劉 洋，劉 鋼，楊 峰，高 健，韓 博

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193 ； 2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038 ； 3.貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550081)

奶牛乳房炎是奶牛常見多發(fā)的疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。在引發(fā)奶牛乳房炎的病原菌中，革蘭陰性菌(如大腸桿菌和克雷伯桿菌)和陽性菌(如金黃色葡萄球菌和鏈球菌)是主要的致病菌[1-2]。在導(dǎo)致奶牛乳房炎的革蘭陰性菌中，大腸桿菌和克雷伯桿菌為最常見的致病菌[3-4]。肺炎克雷伯桿菌作為一種環(huán)境性致病菌，通?？稍陴B(yǎng)牛場的墊料、污水、動物體表和糞便中分離到。奶牛肺炎克雷伯桿菌性乳房炎常發(fā)生在母牛泌乳期，此期發(fā)病的奶牛不但造成其產(chǎn)奶量降低和奶品質(zhì)下降，而且嚴重時還造成急性死亡[5]。目前，針對肺炎克雷伯桿菌引發(fā)的奶牛乳房炎的主要治療措施是抗生素療法，但此療法往往存在著預(yù)后不佳和反復(fù)發(fā)作的問題，且易造成肺炎克雷伯桿菌嚴重的耐藥性。因此，深入研究奶牛乳房炎源性克雷伯桿菌的致病性和耐藥性，為奶牛乳房炎的防治以及篩選和開發(fā)新型替抗產(chǎn)品提供策略。本試驗對樣品中肺炎克雷伯桿菌進行分離鑒定和耐藥性檢測，為研究奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的生物學(xué)特性和致病性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017年12月-2018年12月，在河北某大型奶牛養(yǎng)殖場無菌采集臨床型奶牛乳房炎牛奶樣品共計245份，用于肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定。肺炎克雷伯菌ATCC700603，購自溫州康泰生物科技公司。

1.2 主要試劑 LB營養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、腦心浸液(BHI)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；脫脂綿羊血和革蘭染色試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購自北京華佰泰生物科技有限公司。

1.3 細菌的分離和純化培養(yǎng) 將試驗所需的滅菌棉簽和TSA血平板于超凈工作臺中紫外照射20 min，用棉簽蘸取適量的奶樣在TSA血平板上劃線接種，該平板記為P1板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。取出 P1平板置于超凈臺，用滅菌的接種環(huán)挑取P1平板中單個菌落，利用四區(qū)劃線法接種血平板，該平板記為P2板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。

1.4 細菌的革蘭染色鏡檢 參照革蘭染色試劑盒說明書對細菌進行染色，并進行染色結(jié)果判定。根據(jù)染色后菌體的顏色將細菌分為2類：染色結(jié)果為藍色的細菌通常為革蘭陽性菌株，染色結(jié)果為紅色的通常為革蘭陰性菌株。

1.5 細菌的生化鑒定 對鏡檢結(jié)果為陰性的細菌進行觸媒試驗，若有產(chǎn)氣反應(yīng)(即H2O2液滴有氣泡翻滾)，則記為觸酶陽性，無反應(yīng)者記為觸酶陰性。挑取疑似菌株單菌落接種于生化管內(nèi)，用封口膜將管口封閉，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。根據(jù)腸桿菌科生化鑒定手冊對試驗結(jié)果進行比對判定。

1.6 細菌的DNA鑒定 將細菌過夜培養(yǎng)至平臺生長期，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液獲得細菌，參照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。設(shè)計合成引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，對疑似菌株16S rRNA 基因擴增，PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳試驗。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：1 μL DNA模板，上、下游引物(10 mol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL和ddH2O 7 μL，混勻之后瞬時離心。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,72℃ 90 s，34個循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴增結(jié)束后4 ℃保存。將獲得的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，待電泳結(jié)束后，通過Alpha Imager EC凝膠成像儀觀察電泳凝膠，拍照記錄結(jié)果。

1.7 紙片擴散法檢測細菌的藥物敏感性 將新鮮的菌液加到LB固體培養(yǎng)基上并涂均勻，待其干燥后，將藥敏片貼在LB固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基放置5個藥敏片。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用直尺測量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)，每種藥物做3個平行試驗。依照美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI) 2014版[6]執(zhí)行標準判定結(jié)果：敏感(S)，中介(I)和耐藥(R)。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯桿菌的菌落形態(tài)特征 分離獲得的細菌在LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，可見菌落呈現(xiàn)出圓潤、光滑和表面凸起的形態(tài)(見中插彩版圖1A)。經(jīng)脫脂纖維綿羊血TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，可觀察到菌落形態(tài)呈現(xiàn)出大小2 mm左右、圓形且表面濕潤的特征(見中插彩版圖1B)，均符合肺炎克雷伯桿菌的菌落特征。革蘭染色顯示，該疑似菌株革蘭染色呈紅色，為革蘭陰性菌，且該菌落形態(tài)為桿狀或短棒狀(見中插彩版圖1 C1和C2)，符合肺炎克雷伯桿菌的形態(tài)特征。此外，對分離株進行觸酶試驗，結(jié)果均為觸酶陽性，提示分離株為革蘭陰性菌。

2.2 肺炎克雷伯桿菌的生化鑒定 將分離的細菌接種于腸桿菌科微量編碼生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后，葡萄糖顏色由紫色變成白色，賴氨酸由暗紅色變?yōu)闇\紫色，鳥氨酸由棕色變?yōu)闇\棕色，衛(wèi)茅醇由紫色變?yōu)闊o色，尿素由黃色變?yōu)闇\黃色且有氣泡生成。疑似菌株在葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、衛(wèi)茅醇和尿素生化管中均呈陽性；在硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽生化管均呈陰性。通過將以上生化結(jié)果與腸桿菌科生化鑒定手冊比對分析可知，該細菌的生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征。

2.3 肺炎克雷伯桿菌的分子鑒定 提取細菌基因組DNA，經(jīng)PCR擴增，將45株疑似菌株的PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，疑似菌株可擴增出大小一致的條帶，且與目的條帶大小相符合，約為1 500 bp，如圖2所示，這與肺炎克雷伯桿菌的基因組大小一致。

圖2 部分疑似肺炎克雷伯桿菌PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of suspected Klebsiella pneumoniaeM：DNA Marker； 1～16：部分離菌株的PCR產(chǎn)物條帶； 17：肺炎克雷伯桿菌PCR產(chǎn)物條帶M:DNA Marker; 1～16:PCR product band of partial isolates;17:PCR products of Klebsiella pneumoniae

2.4 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性檢測 分離獲得的肺炎克雷伯桿菌的藥敏試驗結(jié)果見表1。肺炎克雷伯桿菌對青霉素、四環(huán)素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，提示本次分離獲得的肺炎克雷伯桿菌耐藥性嚴重；對頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟的敏感率分別為60%、46.7%和44.4%。

表1 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性分析Table 1 Drug resistance analysis of Klebsiella pneumoniae

3 討論

通過細菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和PCR擴增試驗確認分離菌株為肺炎克雷伯桿菌；藥敏試驗結(jié)果顯示，肺炎克雷伯桿菌對青霉素、四環(huán)素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，對頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟3種藥物敏感。

奶牛乳房炎是由革蘭陰性菌和革蘭陽性菌感染乳腺上皮細胞引起的乳腺疾病。在臨床型奶牛乳房炎中，由病原菌感染引發(fā)的乳房炎嚴重影響產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)以及增加治療成本和死淘率，給乳制品行業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[7]。肺炎克雷伯桿菌是一種常見的環(huán)境性致病菌，針對該菌引發(fā)的奶牛乳房炎通常采用抗生素進行治療，長期使用抗生素導(dǎo)致病原菌耐藥、藥物殘留和肉奶品質(zhì)安全等問題日益突出[8-9]。本試驗通過采集臨床型乳房炎患病奶牛的乳樣，對奶樣中的肺炎克雷伯桿菌進行分離鑒定以及耐藥性分析，為進一步研究奶牛乳房炎性肺炎克雷伯桿菌的致病性提供依據(jù)。

本試驗分離獲得的45株疑似肺炎克雷伯桿菌菌株在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出灰白色、黏液狀、光滑、灰白色與粉紅色交錯、形態(tài)大小一致的菌落，這與張超等[10]報道的肺炎克雷伯桿菌的菌落形態(tài)特征相似。經(jīng)革蘭染色鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)疑似菌株革蘭染色為紅色，表明該菌為革蘭陰性菌，其形態(tài)呈現(xiàn)出單個、成雙或短鏈狀排列、短棒狀或桿狀的特征，這與Lin等[11]報道的肺炎克雷伯桿菌形態(tài)特征相符合。該疑似菌株的觸酶試驗結(jié)果顯示均有氣泡產(chǎn)生，這也進一步表明本試驗分離的疑似菌株為革蘭陰性菌。肺炎克雷伯桿菌屬于腸桿菌科，具有獨特的生物化學(xué)特性。生化結(jié)果顯示，疑似菌株可分解葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、衛(wèi)茅醇和尿素；對硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽則不分解，與腸桿菌科生化鑒定手冊比對分析可知，分離株生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征，且這與林雅等[12]分離出的牛源肺炎克雷伯桿菌生化結(jié)果基本一致。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對病原菌的檢測方法也從細菌的表型觀察逐漸向病原菌的遺傳生物學(xué)特征鑒定轉(zhuǎn)變，一些敏感性高、特異性強的分子快速檢測生物學(xué)技術(shù)(如PCR)在病原菌的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分離株DNA片段大小與目的菌株條帶大小一致，提示所獲得的45株分離株為肺炎克雷伯桿菌。通過分析總結(jié)以上結(jié)果可知，本試驗分離所得的45株細菌為肺炎克雷伯桿菌，分離率為18.4%，表明河北地區(qū)奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的流行率比較高。

抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，但由此造成的細菌耐藥和藥物殘留等問題日益突出，也成為當今眾多國家公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域最為嚴重的問題之一。近年來，肺炎克雷伯桿菌的耐藥情況變的愈發(fā)嚴重，甚至出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象[13-14]。本試驗對分離所得的45株肺炎克雷伯桿菌進行藥敏試驗檢測，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌對青霉素的耐藥達到70%以上，對四環(huán)素、克林霉素、氨芐西林和慶大霉素的耐藥率在40%～55%，對頭孢曲松、頭孢噻肟和卡那霉素3種藥物敏感，這與王樂等[15]的報道有區(qū)別。細菌耐藥性的不同與獲得病原菌的地域、季節(jié)和牛場管理模式以及牛場日常用藥等有密切關(guān)系，而且同一種屬細菌對相同藥物的耐藥性也存在一定差異。本試驗結(jié)果表明，從臨床型乳房炎患牛奶樣中分離的肺炎克雷伯桿菌表現(xiàn)出嚴重的耐藥性，說明了河北地區(qū)引起奶牛乳房炎的肺炎克雷伯桿菌的耐藥性問題比較嚴重，尋求新型替抗產(chǎn)品治療肺炎克雷伯桿菌引起的奶牛乳房炎迫在眉睫。

綜上所述，本試驗通過從細菌的菌落生長形態(tài)特征、生化特性和分子遺傳學(xué)特征等方面對分離疑似菌株進行鑒定，確定分離45株細菌屬于肺炎克雷伯桿菌，藥敏試驗結(jié)果表明，分離的肺炎克雷伯桿菌具有嚴重的耐藥性，為河北省肺炎克雷伯桿菌引發(fā)的奶牛乳房炎防治提供科學(xué)理論依據(jù)。