劉瓊丹，黎 敏，朱兆榮,2，劉 娟,2

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460 ； 2.重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，重慶 榮昌 402460)

雛雞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，由于體溫調(diào)節(jié)機(jī)制不健全、消化系統(tǒng)發(fā)育不健全、抵抗力弱等生理特點(diǎn)，使其容易遭受外邪入侵，從而導(dǎo)致發(fā)病，嚴(yán)重影響雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，中藥具有防病促生長(zhǎng)的作用[1-3]。故根據(jù)中藥配伍原則，選用自擬方蒲翹散為受試藥物，主要由蒲公英、金銀花、連翹等中藥材組成，此中藥方具有清熱解毒、理氣健脾等功效，蒲公英、金銀花、連翹具有提高機(jī)體免疫的功能[4-6]。由于中草藥的細(xì)胞具有細(xì)胞壁，常規(guī)的一些提取方法很難將其破壞，導(dǎo)致包漿中的有效成分提取不充分，提取率降低、使中草藥藥效降低[7]。大量研究表明，經(jīng)微生物發(fā)酵后，有效成分釋放出來(lái)，可以使中草藥有效成分提取率提高，毒性降低、藥效提高。枯草芽孢桿菌是生存能力強(qiáng)的好氧菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、提高生長(zhǎng)性能等諸多功能，被認(rèn)為是最理想的益生菌[8]，因此廣泛應(yīng)用于中藥發(fā)酵的研究。本試驗(yàn)通過(guò)自擬方蒲翹散，以枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，篩選出最佳發(fā)酵條件，并通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵處方的藥效進(jìn)行初步觀察，為蒲翹散發(fā)酵物的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及藥材 枯草芽孢桿菌(由本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供)，蒲公英、金銀花、連翹等，購(gòu)自重慶市迪盛醫(yī)藥有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(BR，批號(hào):20160408)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(BR，批號(hào):20160116)，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；蘆丁對(duì)照品，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):100080-201409。

1.3 主要儀器 立式壓力蒸汽滅菌器(型號(hào)：YXQ-LS-30S)，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：GNP-9080)，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLL-16A型低溫離心機(jī)，購(gòu)自海菲恰爾分析儀有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡健康紅羽肉雞，公母各半，初始平均體重為51.29 g/只，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供。

1.5 蒲翹散發(fā)酵條件篩選

1.5.1 發(fā)酵菌種的活化 將保存的枯草芽孢桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代2次后的菌液用鉤菌環(huán)將其接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落于裝有10 mL液體培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱中備用。

1.5.2 種子液的制備 將活化好的枯草芽孢桿菌按1%的量接種于裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，于震蕩培養(yǎng)箱，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱保存，備用。

1.5.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取蘆丁對(duì)照品9.7 mg，精密稱量，置于50 mL量瓶中，加適量的甲醇溶解，再加蒸餾水至刻度，搖勻，即得對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(每1 mL含蘆丁0.194 mg)。精密量取對(duì)照品溶液，0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和3.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，各加蒸餾水至3 mL，加5%亞硫酸鈉溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；再加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，混勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，以加對(duì)照品溶液0.0 mL的試劑為空白，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為中藥發(fā)酵物黃酮含量檢測(cè)備用。

以相應(yīng)試劑為空白，在波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)吸光度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見(jiàn)圖1，得到回歸方程：y=12.242x-0.010 6，R2=0.998 3。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)濃度在0.005～0.06 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 采用單因素試驗(yàn)方法對(duì)初始pH值、發(fā)酵溫度、接菌量、轉(zhuǎn)速、時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，每組3個(gè)平行，并測(cè)定總黃酮含量，確定最佳發(fā)酵條件。

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值：對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵前的pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)進(jìn)行篩選。(2)發(fā)酵溫度：對(duì)不同溫度(25、30、35、40 ℃和45 ℃)進(jìn)行篩選。(3)發(fā)酵接菌量：對(duì)不同接菌量(0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)進(jìn)行篩選。(4)發(fā)酵轉(zhuǎn)速：對(duì)不同轉(zhuǎn)速(120、150、180、210 r/min 和240 r/min)進(jìn)行篩選。(5)發(fā)酵時(shí)間：對(duì)不同時(shí)間(12、24、36、48 h和60 h)進(jìn)行篩選。

1.5.5 優(yōu)化發(fā)酵條件驗(yàn)證 將以上優(yōu)化后的發(fā)酵條件組合，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并將蒲翹散藥液與發(fā)酵液進(jìn)行比較，每組3個(gè)平行，發(fā)酵后對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.6 對(duì)肉雛雞生產(chǎn)性能和免疫功能的影響

1.6.1 動(dòng)物分組與處理 用1日齡健康紅羽肉雛雞180只，隨機(jī)分為空白組、菌液組(菌液組)，發(fā)酵藥液組(即未經(jīng)滅菌處理的)I、II、III組，發(fā)酵藥液滅菌組(IV組)，共6個(gè)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。各組處理為：空白組肉雞飼料中添加0.5%的蒸餾水；菌液組添肉雞飼料中加0.5%的菌液(含菌量與試驗(yàn)II組一致); 發(fā)酵藥液I、II、III組肉雞飼料中分別添加蒲翹散發(fā)酵液0.25%、0.5%、1.0%；發(fā)酵藥滅菌組肉雞飼料中添加0.5%的經(jīng)滅菌處理的蒲翹散發(fā)酵物。8日齡接種新-流二聯(lián)苗，21日齡接種傳染性囊病活疫苗，以點(diǎn)眼滴鼻方式接種，飼料配方及營(yíng)養(yǎng)見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平 (%)

1.6.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.2.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo) 試驗(yàn)期間，每天記錄飼喂飼料量，剩余飼料量，灑落飼料量，并計(jì)算出每天的實(shí)際采食量。計(jì)算各階段平均日增重、料重比。平均日增重=(階段末重-階段始重)/階段天數(shù)；料重比=階段實(shí)際總采食量/階段總增重。

1.6.2.2 免疫器官指數(shù) 將上述46日齡雛雞采血后致死，取脾臟、法氏囊稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。免疫器官指數(shù)=免疫器官重量(g)/宰前空腹活重(100 g)。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和簡(jiǎn)單處理，再用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件用方差分析度數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2. 1 發(fā)酵條件優(yōu)化后對(duì)蒲翅散發(fā)酵液中總黃酮含量的影響 由圖2(A)可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值的增大，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮的含量先增加后降低，當(dāng)初始pH值為5.0時(shí)蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達(dá)到最高，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在5.0～5.5時(shí)，蒲翹散發(fā)酵液中的總黃酮含量變化不明顯，由于其發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵前未經(jīng)調(diào)節(jié)的pH值在5.2～5.4，最后確定發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值5.2～5.4為最佳。由圖2(B)可知，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量隨溫度的增加呈現(xiàn)先增加后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達(dá)到最高，因此，采用35 ℃為最佳發(fā)酵溫度。由圖2(C)可知，當(dāng)接菌量為2%時(shí)蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量達(dá)到最高，超過(guò)2%時(shí)蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量反而降低，因此，采用2%為最佳發(fā)酵接菌量。由圖2(D)可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量也逐漸增加，在210 r/min時(shí)總黃酮含量達(dá)到最高，轉(zhuǎn)速超過(guò)210 r/min時(shí)，蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量反而降低。因此，采用轉(zhuǎn)速為210 r/min為最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速。由圖2(E)可知，總黃酮含量隨著時(shí)間的不同呈現(xiàn)出一定的周期性變化，每隔24 h總黃酮含量上升后又下降，分別在24 h和48 h處出現(xiàn)峰值，但在24 h時(shí)蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含量最高，發(fā)酵時(shí)間相比較短，因此，采取發(fā)酵24 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。圖2(F)可知，發(fā)酵后蒲翹散發(fā)酵液中總黃酮含為83.150 mg/g，未發(fā)酵蒲翹散中總黃酮含量為79.065 mg/g，發(fā)酵比未發(fā)酵蒲翹散總黃酮提取含量增加5.17%。

2.7 蒲翹散發(fā)酵液對(duì)肉雛雞生長(zhǎng)性能的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0～21日齡階段，各試驗(yàn)組肉雛雞的平均日增重高于空白組，差異極顯著(P<0.01)。各試驗(yàn)組肉雛雞的料重比低于空白組，差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅱ組肉雛雞的平均日增重與空白組比較增加27.3%，料重比與空白組比較降低12.1%。在21～46日齡階段，與空白組比較，各試驗(yàn)組平均日增重增加，差異極顯著(P<0.01)；與空白組比較，菌液組肉雛雞平均日增重增加18.5%，試驗(yàn)Ⅰ組肉雛雞增加8.7%，試驗(yàn)Ⅱ組肉雛雞增加7.0%，試驗(yàn)Ⅲ組增加5.7%，試驗(yàn)Ⅳ組肉雛雞增加19.8%。各試驗(yàn)組的料重比與空白組比較，差異顯著(P<0.05)，其中試驗(yàn)Ⅱ組的料重比最小，比空白組降低18.2%。見(jiàn)表2。

2.8 發(fā)酵物對(duì)肉雛雞免疫器官指數(shù)的影響 結(jié)果顯示，與空白組比較，試驗(yàn)Ⅱ組和Ⅳ組肉雛雞的脾臟指數(shù)，差異顯著(P<0.05)。各試驗(yàn)組肉雛雞的法氏囊指數(shù)，差異都不顯著(P>0.05)，其中除試驗(yàn)Ⅱ組外，其他組肉雞的法氏囊指數(shù)都高于空白組。綜合上述結(jié)果可以得到蒲翹散發(fā)酵物對(duì)肉雛雞的免疫器官發(fā)育都有一定的促進(jìn)作用，其中蒲翹散發(fā)酵經(jīng)滅菌的藥物對(duì)肉雛雞脾臟和法氏囊的增重效果最好，見(jiàn)表3。

表2 蒲翹散發(fā)酵物對(duì)肉雛雞生長(zhǎng)性能指標(biāo)影響

3 討論

蒲翹散主要由蒲公英、金銀花、連翹等中藥材組成，具有清熱解毒、理氣健脾等功效。研究表明，大多數(shù)清熱解毒的中藥具有抗菌、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，理氣健脾的中藥可以調(diào)節(jié)腸胃、促進(jìn)消化[9]，因此根據(jù)中藥處方配伍原則，選擇蒲翹散作為受試藥物。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的2種芽孢桿菌之一，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用。枯草芽孢桿菌作為一種益生菌被研究者們廣泛應(yīng)用于各種發(fā)酵研究，在發(fā)酵過(guò)程中，適宜發(fā)酵條件對(duì)菌株的發(fā)酵水平有很大影響，在不同的發(fā)酵條件下產(chǎn)酶量也不同?？莶菅挎邨U菌自身生長(zhǎng)也需要一定的條件，如溫度、pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵轉(zhuǎn)速等都影響其生長(zhǎng)。pH值會(huì)影響微生物對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最終影響微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成[10]。溫度在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)影響其胞內(nèi)生物大分子的活性來(lái)影響微生物的代謝活動(dòng)，溫度太高或太低都會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)造成不利的影響。接種量過(guò)小容易造成發(fā)酵周期的延長(zhǎng)，而接種量過(guò)大又會(huì)引入較多的代謝廢物及快速的消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，影響誘導(dǎo)酶的合成[11-13]。黃酮類物質(zhì)是許多中藥的活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[14]。本試驗(yàn)自擬方蒲翹散，其主要成分蒲公英、金銀花、連翹等含有黃銅成分[15-17]，因此，選用黃酮含量作為發(fā)酵條件優(yōu)化的判斷依據(jù)。本試驗(yàn)得出，蒲翹散發(fā)酵條件為：發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值5.2～5.4，溫度35 ℃，接菌量2%，轉(zhuǎn)速210 r/min，發(fā)酵24 h。優(yōu)化后的初始pH值和溫度與文獻(xiàn)[18]研究的枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件初始pH值為6.0，溫度為35 ℃結(jié)果相近。接菌量和發(fā)酵轉(zhuǎn)速與文獻(xiàn)[19]研究的枯草芽孢桿菌B908的發(fā)酵結(jié)果(接菌量2%，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min)相似。發(fā)酵優(yōu)化后總黃酮含量提高5.17%，與文獻(xiàn)[20]結(jié)果一致。

表3 蒲翹散發(fā)酵物對(duì)肉雛雞免疫臟器指數(shù)的影響 (g/100 g)

發(fā)酵中藥主要被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)，主要用于抗病、促生長(zhǎng)等，通常將發(fā)酵后的中藥添加到飼料中，來(lái)代替抗生素的使用。發(fā)酵中藥組對(duì)肉雛雞的生產(chǎn)性能作用顯著高于中藥組[21]。張凱等研究表明，發(fā)酵黃芩提取物能顯著降低乳酸脫氫酶的活性[22]。發(fā)酵黃芪藥渣能夠提高青腳麻雞的生產(chǎn)性能以及免疫力水平[23]。本試驗(yàn)表明，蒲翹散發(fā)酵藥物對(duì)肉雛雞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。結(jié)果與上述研究一致，但不同添加劑量對(duì)肉雛雞的生長(zhǎng)性能的影響有所不同，在添加劑量為0.5%時(shí)最為合適。

Rivas等研究發(fā)現(xiàn)，胸腺、脾臟和法氏囊的重量可以用來(lái)衡量雛雞的免疫力水平[24]。法氏囊是誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞分化和成熟的場(chǎng)所；胸腺是T淋巴細(xì)胞分化成熟的免疫中樞器官，胸腺會(huì)因?yàn)槟挲g的增長(zhǎng)而逐漸退化；禽類的脾臟主要參與免疫功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組肉雛雞的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有不同程度的增加，與文獻(xiàn)[25]結(jié)果一致，證明蒲翹散發(fā)酵液能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育。

綜上所述，蒲翹散的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值5.2～5.4，溫度35 ℃，接菌量2%，轉(zhuǎn)速210 r/min，發(fā)酵24 h，發(fā)酵優(yōu)化后總黃酮含量提高5.17%。發(fā)酵后能提高肉雛雞的生長(zhǎng)性能并對(duì)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育也有一定的促進(jìn)作用。