霍穎浩，王 進(jìn)，殷立新

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，2藥學(xué)部，河北石家莊050000）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)緩慢、震顫、感覺障礙等。PD 多發(fā)生于老年人群，隨著社會老齡化的加劇，PD 發(fā)病率呈增長趨勢［1］。目前，PD 的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，已證實(shí)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥等引起的細(xì)胞凋亡與PD 關(guān)系密切［2-3］。臨床主要采用左旋多巴治療PD，但長期療效不佳，因此探究PD發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)十分重要。

青藤堿（sinomenine，SN）是中藥青風(fēng)藤的主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等多種藥理學(xué)功效［4-5］。研究顯示，SN可改善缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元形態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)元存活，抑制神經(jīng)元凋亡［6］。SN 可抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及乳酸脫氫酶的釋放，減輕神經(jīng)元的損傷［7］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個(gè)核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等多個(gè)方面調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞生長、分化和凋亡等生命過程，與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。ANRIL 是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA。研究顯示，ANRIL 在PD 患者體內(nèi)差異性表達(dá)［9］。生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，微小RNA-626（microRNA-626，miR-626）的靶基因可能是ANRIL。研究顯示，miR-626 在PD 患者腦脊液中表達(dá)降低，可能是PD診斷和監(jiān)測的新的生物標(biāo)志物［10］。

本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH 細(xì)胞為研究對象，主要探討SN對1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridine，MPP+）誘導(dǎo) SK-N-SH 細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響，并以ANRIL/miR-626 為切入點(diǎn)，探討SN 減輕MPP+所致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，以期為PD的治療提供新思路。

材料和方法

1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；Trizol試劑和 LipofectamineTM2000 試劑盒（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人Bcl-2 和Bax 多克隆抗體（Abcam）；雙螢光素酶活性檢測試劑盒（北京威格拉斯生物技術(shù)有限公司）；靶向ANRIL的小干擾RNA［ANRILsmall interfering RNA（siRNA），si-ANRIL］及亂序無意義陰性序列（negative control siRNA，si-NC），ANRIL過表達(dá)載體（pcDNA-ANRIL）及空載體（pcDNA），miR-626 模擬物（mimics）及陰性對照（上海吉?jiǎng)P基因公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SK-N-SH 細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、97%濕度）中培養(yǎng)。每2～3 d 更換1 次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入適量預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞。吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的SK-N-SH 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6 孔板中。待細(xì)胞匯合至60%時(shí)，分別將si-ANRIL、si-NC、pcDNA-ANRIL 及pcDNA轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染過程參照Lipo?fectamineTM2000試劑盒說明書。轉(zhuǎn)染后12 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，采用RT-qPCR檢測細(xì)胞中ANRIL 水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組和處理 未轉(zhuǎn)染的SK-N-SH 細(xì)胞分為對照（control，Con）組（細(xì)胞正常培養(yǎng)）、MPP+組（100 μmol/L［11］的 MPP+作用細(xì)胞 24 h）、MPP++SN-L組、MPP++SN-M 組和MPP++SN-H 組（濃度分別為5、10、20 μmol/L［6］的SN 與100 μmol/L 的MPP+共同作用細(xì)胞 24 h）。轉(zhuǎn)染 si-ANRIL 和 si-NC 的 SK-N-SH 細(xì)胞均用 100 μmol/L 的 MPP+作用 24 h，分別記為 MPP++si-ANRIL 組和MPP++si-NC 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-ANRIL和 pcDNA 的 SK-N-SH 細(xì)胞均用 20 μmol/L 的 SN 與100 μmol/L 的 MPP+共同作用 24 h，分別記為 MPP++SN+pcDNA-ANRIL組和MPP++SN+pcDNA組。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 未轉(zhuǎn)染的SK-NSH 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的 SK-N-SH 細(xì)胞，以每孔 1×104個(gè)接種于24孔板中。細(xì)胞貼壁后，按照2.3分組處理，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。胰蛋白酶消化?xì)胞，PBS 清洗細(xì)胞2 次。取含1.0×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，加入400μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入10 μL annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5μL PI，室溫避光孵育5 min。再加入100μL結(jié)合緩沖液，混勻后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA 和GSH 水平的檢測將2.4 收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液3 500 r/min 離心10 min，分別參照MDA 和GSH 試劑盒說明書檢測上清中MDA和GSH水平。

2.6 Western blot 法檢測細(xì)胞中 Bax 和 Bcl-2 蛋白 的表達(dá)水平 RIPA 蛋白裂解液各組細(xì)胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min，上清液即為總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。取適量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg 蛋白行SDS-PAGE（5%濃縮膠，10%分離膠）。電泳后，將分離的蛋白條帶濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，并于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入抗Bax 和Bcl-2 抗體（1∶400 稀釋），4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG（1∶200 稀釋），37℃孵育1 h。加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH 為內(nèi)參照，ImageJ 軟件分析目的蛋白條帶灰度值。目的蛋白水平以其與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 檢 測 細(xì) 胞 中 ANRIL 和 miR-626 的 表達(dá)水平 Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度后，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為20 μL，其中上、下游引物各0.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃ 5 s，60℃60 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。ANRIL 的上游引物序列為5'-TGAACGTGCCCGATGCTGG-3'，下游引物序列為 5'-CCGTGCCTTGAGCTAGCTC-3'；miR-626 的 上游引物序列為5'-GTGCGATCGTAAACCGTC-3'，下游引物序列為5'-CCGTGAAATGCTAGCTGA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TGAACGGGAAGCT?CACTGG-3'，下游引物序列為5'-TCCACCACCCT?GTTGCTGTA-3'；U6 的上游引物序列為5'-CTC?GCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AAC?GCTTCACGAATTTGCGT-3'。ANRIL 以 GAPDH 為內(nèi)參照，miR-626 以 U6 為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算ANRIL和miR-626的相對表達(dá)水平。

2.8 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ANRIL 和miR-626 的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)軟件預(yù)測ANRIL 與miR-626 的結(jié)合片段。PCR 擴(kuò)增含miR-626 結(jié)合位點(diǎn)的ANRIL 序列，并將其插入至pMIR-REPORT 中，構(gòu)建ANRIL 野生型質(zhì)粒（WT-ANRIL）；再利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變，構(gòu)建ANRIL 突變型質(zhì)粒（MUT-ANRIL）。分別將ANRIL-WT、ANRIL-MUT 與miR-626 mimic、陰性對照共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 后，收集細(xì)胞。參照雙螢光素酶活性檢測試劑盒說明書，檢測螢光素酶相對活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SN對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與control 組比較，MPP+組的MDA 水平升高（P＜0.05），GSH 水平降低（P＜0.05）；與 MPP+組比較，MPP++SN-L 組 、MPP++SN-M 組 和 MPP++SN-H 組 的MDA 水平降低（P＜0.05），GSH 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SN-H 組 3組間MDA 和GSH 水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖1。

2 SN對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

與control 組比較，MPP+組細(xì)胞的凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P＜0.05）；與 MPP+組比較，MPP++SN-L 組、MPP++SN-M組和MPP++SN-H 組的細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），且MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SN-H 組 3 組間細(xì)胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖2。

3 SN 對 MPP+誘 導(dǎo) SK-N-SH 細(xì) 胞 中 ANRIL 和miR-626表達(dá)的影響

與control 組比較，MPP+組細(xì)胞中ANRIL 水平升高（P＜0.05），miR-626 水平降低（P＜0.05）；與MPP+組比較，MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和 MPP++SNH 組的ANRIL 水平降低（P＜0.05），miR-626 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 組、MPP++SN-M 組和MPP++SN-H 組 3 組間 ANRIL 和 miR-626 水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），見圖3。

4 ANRIL靶向調(diào)控miR-626的表達(dá)

Figure 1.The effect of SN on MPP+-induced oxidative stress in the SK-N-SH cells.The levels of MDA（A）and GSH（B）in the SKN-SH cell culture supernatants were detected.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖1 SN對MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

Figure 2.The effect of SN on the apoptosis of the SK-N-SH cells induced by MPP+.A：the apoptotic rate of the SK-N-SH cells was de?termined by flow cytometry；B：the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+ group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖2 SN對MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.The effect of SN on the expression of ANRIL（A）and miR-626（B）in the SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.圖3 SN對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞中ANRIL和miR-626表達(dá)的影響

由圖4A 可見，生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示ANRIL序列中含有與miR-626 互補(bǔ)的核苷酸序列。雙螢光素酶活性檢測結(jié)果顯示，miR-626 可降低WT-ANRIL的螢光素酶活性（P＜0.05），而對MUT-ANRIL 的螢光素酶活性無顯著影響（P＜0.05），見圖4B。與pcDNA組比較，pcDNA-ANRIL 組的 miR-626 水平降低（P＜0.05）；與 si-NC 組比較，si-ANRIL 組的 miR-626 水平升高（P＜0.05），見圖4C。這些結(jié)果說明ANRIL 靶向負(fù)調(diào)控miR-626的表達(dá)。

Figure 4.ANRIL targeted miR-626 and regulated its expression.A：ANRIL contains the nucleotide sequences complementary to miR-626；B：the dual-luciferase reporter experiment results；C：ANRIL regulated miR-626 expression.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNAgroup；&P＜0.05 vs si-NC group.圖4 ANRIL靶向調(diào)控miR-626表達(dá)

5 敲減ANRIL 的表達(dá)對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH 細(xì)胞損傷的影響

MPP++si-ANRIL 組的 ANRIL 水平低于 MPP++si-NC組，miR-626水平高于MPP++si-NC組，見圖5A、B。這表明si-ANRIL 在MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中ANRIL 表達(dá)受到抑制，而受ANRIL抑制的miR-626 表達(dá)水平升高。與MPP++si-NC 組比較，MPP++si-ANRIL 組的細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白水平和 MDA 水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白和GSH 水平升高（P＜0.05），見圖5C～F。

Figure 5.The effect of ANRIL expression knock-down on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect of ANRIL small interfering RNA（si-ANRIL）after transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfection of si-ANRIL；C：the effect of ANRIL expression knock-down on the apoptotic rate of SK-N-SH cells induced by MPP+；D：the effect of ANRIL expression knock-down on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells induced by MPP+；E：the effect of ANRIL expression knock-down on MDA content in the culture supernatants of SK-N-SH cells in?duced by MPP+；F：the effect of ANRIL expression knock-down on GSH content in the culture supernatants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP++si-NC group.圖5 敲減ANRIL表達(dá)對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的影響

6 ANRIL 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SN 對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的作用

MPP++SN+pcDNA-ANRIL 組 的 ANRIL 水 平 高 于MPP++SN+pcDNA 組，表明ANRIL過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中ANRIL 過表達(dá)，見圖6A。與MPP++SN+pcDNA 組比較，MPP++SN+pcDNA-ANRIL 組的細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)和MDA 水平均升高（P＜0.05），miR-626 表達(dá)、Bcl-2 蛋白和 GSH 水平均降低（P＜0.05），見圖6B～F。

討 論

Figure 6.Over-expression of ANRIL reversed the effects of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect ofANRIL over-expression vector transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfected with ANRIL over-expression vector；C：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell apoptosis；D：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells in?duced by MPP+；E：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MDA content in the culture supernatants of SK-NSH cells induced by MPP+；F：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on GSH content in the culture superna?tants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP+group；#P＜0.05 vs MPP++SN+pcDNA group.圖6 ANRIL過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SN對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的作用

PD 是多發(fā)生于老年人的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。氧化應(yīng)激等引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡與PD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［12-13］。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平高低可反映細(xì)胞氧化損傷程度［14］。GSH 是抗氧化劑，可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力［15］。本研究顯示MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH 細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA 水平升高，GSH 水平降低，細(xì)胞凋亡率增加，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致［16］，說明SK-N-SH 細(xì)胞在MPP+誘導(dǎo)后發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡，細(xì)胞受損。與PD的病理過程有相似之處。

SN 是從中藥青風(fēng)藤中分離提純獲得的活性堿，在臨床上主要用于治療系膜增生性腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病［17］。研究還顯示SN 對腦出血、腦缺血、神經(jīng)退行性疾病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型具有神經(jīng)保護(hù)作用［18］。但SN 在PD 中的作用及機(jī)制還未知。本研究顯示，SN 可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞上清液的MDA 水平，提高GSH 水平，說明SN 通過抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞氧化應(yīng)激減輕細(xì)胞損傷。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞基本的生理過程，有助于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。Bcl-2 和Bax 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Bcl-2表達(dá)升高可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax 表達(dá)升高則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究顯示，SN 可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞凋亡率和Bax 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2 蛋白表達(dá)，提示SN 通過調(diào)控Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞凋亡。

lncRNA 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，可作為該類疾病的治療靶點(diǎn)［19］。研究顯示，抑制ANRIL基因表達(dá)可通過阻斷核因子κB 信號傳導(dǎo)途徑減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變［20］。本研究顯示，MPP+誘導(dǎo)后，SK-N-SH 細(xì)胞中的ANRIL 表達(dá)水平升高，而SN可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞中ANRIL 水平，提示ANRIL 可能參與神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生發(fā)展，是潛在的PD 治療的作用靶點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)染si-ANRIL至SK-N-SH細(xì)胞敲減ANRIL表達(dá)后，MPP+誘導(dǎo)的SKN-SH細(xì)胞凋亡及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA水平降低，GSH 水平升高，說明敲減ANRIL表達(dá)可降低MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。本研究還顯示，ANRIL 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SN 對MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡及MDA 和GSH 表達(dá)的影響，提示SN 通過下調(diào)細(xì)胞中ANRIL 表達(dá)減輕MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH 細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步探討SN 通過下調(diào)ANRIL 表達(dá)減輕MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行測試，結(jié)果顯示miR-626 的靶基因可能是ANRIL。研究表明miR-626過表達(dá)可保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡［21］。目前，miR-626 對MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞損傷的影響還不清楚。本研究通過雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及RT-qPCR檢測證實(shí)了ANRIL 在SK-N-SH 細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控miR-626 表達(dá)，這也與 SN 降低 MPP+誘導(dǎo)的 SK-N-SH 細(xì)胞ANRIL 表達(dá)并促進(jìn)miR-626 表達(dá)的結(jié)果一致，提示SN 可能通過下調(diào)細(xì)胞中ANRIL 表達(dá)進(jìn)而上調(diào)miR-626 表達(dá)，從而抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

綜上所述，本研究從細(xì)胞層面進(jìn)行的初步探討結(jié)果提示SN 可抑制MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，其機(jī)制可能是通過調(diào)控ANRIL/miR-626 通路發(fā)揮作用。了解上述病理變化可為探討PD的發(fā)病機(jī)制提供參考。