王叨，張永卓，陳嬌，游紅亮，丁艷杰，魏林林，徐巖，劉玉峰

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 兒內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.濮陽市人民醫(yī)院 兒內(nèi)科，河南 濮陽 457000)

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)是從丹參中分離出的二萜醌類化合物，臨床主要用來治療心血管疾病和缺血性腦卒中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Tan ⅡA不僅對多種腫瘤細胞有抗增殖活性，還可協(xié)同增強多種化療藥物的抗腫瘤活性[1-4]，但其作用的具體分子機制尚不十分清楚。本研究以人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4為研究對象，擬從細胞凋亡和自噬角度，探討Tan ⅡA聯(lián)合三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)體外對白血病細胞增殖的影響及其可能的分子機制，為臨床采用Tan ⅡA輔助治療白血病提供基礎實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料所用NB4細胞來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院細胞室，Tan ⅡA來自中國藥品生物制品檢定所，流式細胞儀來自美國Becton Dickinson公司，1 g·L-1亞砷酸注射液來自哈爾濱伊達制藥廠，CCK-8試劑盒來自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit來自南京凱基生物科技有限公司，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)來自美國Sigma公司，兔抗人Beclin 1抗體、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅱ抗體、鼠抗人actin抗體、小鼠抗人半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗體均來自美國Sigma公司，BCA蛋白檢測試劑盒來自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 NB4細胞接種于含體積分數(shù)10%的胎牛血清、105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，共分6組：4、8、16 mg·L-1Tan ⅡA組，0.5 mg·L-1ATO組，8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO組，對照組加入9 g·L-1生理鹽水。

1.2.3流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測細胞凋亡率 收集藥物處理48 h后的細胞1×106個，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌后，重懸于500 L緩沖液，分別加入5 L Annexin-V-FITC、5 L碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻，室溫避光15 min，PBS洗滌后上機檢測。

1.2.4FCM法檢測細胞自噬小體率 收集藥物處理48 h后的細胞1×106個，PBS洗滌后，重懸于500 L緩沖液，加入0.05 mmol·L-1的MDC染液100 L，混勻，室溫避光15 min，PBS洗后上機檢測。

1.2.5蛋白質(zhì)印跡法檢測Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ 收集藥物處理48 h后的各組細胞，加入細胞裂解液，混勻后冰上裂解40 min，離心收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。以50 g總蛋白進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，次日洗滌后加入相應二抗孵育2 h，洗滌后進行X線膠片顯影。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖活力MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著Tan ⅡA作用時間的延長和質(zhì)量濃度的增加，NB4細胞增殖抑制率呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(F=65.093，P=0.023)，說明Tan ⅡA對NB4細胞增殖有抑制作用，且呈一定的劑量和時間依賴性。在同一時間點上，聯(lián)合用藥組細胞的增殖抑制率大于同劑量單藥組(均P<0.05)。見表1。

表1 MTT法檢測各組NB4細胞增殖抑制率

2.2 NB4細胞凋亡率藥物作用48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組細胞凋亡率分別為(11.28±3.32)%、(32.69±5.60)%，均高于對照組的(2.81±0.93)%，差異有統(tǒng)計學意義(t1=4.253，P1=0.025；t2=9.110，P2=0.001)。聯(lián)合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞凋亡率為(44.02±6.47)%，高于單藥組(t1=8.235，P1=0.027；t2=13.790，P2=0.005)。見圖1。

圖1 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞凋亡的影響

2.3 NB4細胞自噬小體率藥物作用48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組細胞的自噬小體率分別為(18.42±7.63)%、(34.36±7.60)%，均高于對照組的(5.07±1.62)%，差異有統(tǒng)計學意義(t1=7.953，P1=0.006；t2=6.773，P2=0.004)。聯(lián)合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞自噬小體率為(53.26±7.39)%，高于單藥組(t1=6.367，P1=0.001；t2=9.471，P2=0.037)。見圖2。

圖2 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞自噬的影響

2.4 凋亡特異蛋白Caspase-3表達水平蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，藥物處理48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組的NB4細胞內(nèi)Caspase-3相對表達量較對照組高(t1=8.030，P1=0.003；t2=12.246，P2=0.002)。兩藥聯(lián)合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞內(nèi)Caspase-3相對表達量高于8 mg·L-1Tan ⅡA組和0.5 mg·L-1ATO組(t1=19.575，P1=0.005；t2=4.067，P2=0.036)。見圖3。

圖3 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞內(nèi)Caspase-3表達的影響

2.5 自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，藥物處理48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組NB4細胞內(nèi)蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量均高于對照組(t1=3.761，P1=0.039；t2=6.840，P2=0.001)。兩藥聯(lián)合組NB4細胞內(nèi)Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量高于8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組(t1=9.423，P1=0.003；t2=7.568，P2=0.013)。見圖4。

圖4 NB4細胞內(nèi)自噬特異性蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的相對表達量

3 討論

本實驗以3種不同質(zhì)量濃度的Tan ⅡA與急性早幼粒白血病NB4細胞共同培養(yǎng)， MTT檢測結(jié)果顯示，隨著藥物質(zhì)量濃度的提高和作用時間的延長，NB4細胞活力呈下降趨勢，表明本實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的Tan ⅡA對NB4細胞增殖有抑制作用，且呈一定的時間和劑量相關(guān)性。Tan ⅡA聯(lián)合ATO組NB4細胞的增殖抑制率大于單藥組，與部分文獻報道[5-7]一致，表明Tan ⅡA可協(xié)同增強ATO的抗白血病細胞增殖活性，提示Tan ⅡA可作為增強ATO化療效果的輔助藥物，但其具體分子作用機制和作用靶點尚不完全清楚。

自噬和凋亡是兩種主要的細胞程序性死亡方式，雖然生化代謝途徑及形態(tài)學存在差異，但功能密切聯(lián)系，共同調(diào)控細胞生存和死亡[8]，因而成為多種抗腫瘤藥物的作用靶點。本研究團隊推測Tan ⅡA對ATO抗白血病化療的增敏作用機制可能與凋亡和自噬有關(guān)。

Tan ⅡA和ATO處理NB4細胞48 h后，經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)，Tan ⅡA、ATO單藥均可誘導NB4細胞凋亡，兩藥聯(lián)合組細胞凋亡率大于單藥組，提示促進細胞凋亡是Tan ⅡA協(xié)同ATO抗白血病的作用機制之一。Caspase-3是Caspase家族蛋白中凋亡效應蛋白酶，是凋亡的終末執(zhí)行器[9]。本研究蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，Tan ⅡA和ATO聯(lián)合用藥組細胞Caspase-3表達量高于單藥組和對照組，提示上調(diào)Caspase-3表達是Tan ⅡA協(xié)同ATO誘導NB4細胞凋亡的分子機制之一。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)的過程，對細胞的存活和死亡起著舉足輕重的作用。自噬既可以作為一種防御機制清除細胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器和大分子物質(zhì)，保護受損的細胞，同時還可作為一種Ⅱ型程序性死亡方式誘導細胞主動性死亡[10-11]，即自噬性細胞死亡。在自噬過程中，自噬溶酶小體的形成是關(guān)鍵[12]。本研究經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)，Tan ⅡA可協(xié)同增強ATO誘發(fā)的細胞自噬活性。因此，本研究團隊認為Tan ⅡA協(xié)同ATO抗白血病化療增敏機制也與增強NB4細胞自噬活性、誘發(fā)細胞自噬性死亡有關(guān)。

自噬是一個受基因嚴格調(diào)控的程序性過程，涉及一系列自噬相關(guān)蛋白，其中的核心自噬特異蛋白包括Beclin-1、LC3。Beclin-1可與Barkor/Atg14(L)、hVps15、Class Ⅲ PI3K/hVps34相互結(jié)合組成一個特異性PI3K復合物[13-15]，調(diào)控自噬前體和自噬體的形成和成熟。自噬啟動后，LC3被裂解為LC3-Ⅱ，后者與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)共價結(jié)合形成脂化的LC3-Ⅱ-PE復合物[14]，參與自噬泡和自噬小體內(nèi)外膜的延伸，其水平的高低可反映細胞自噬水平。本研究通過蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，Tan ⅡA和ATO聯(lián)合用藥組NB4細胞內(nèi)的自噬特異蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量高于單藥組和對照組，說明Tan ⅡA協(xié)同ATO增強NB4細胞自噬活性的機制與其促進自噬特異蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ高表達有關(guān)。有研究報道Tan ⅡA可誘導人口腔鱗狀細胞癌SCC-9細胞自噬性死亡并伴有Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的高表達[16]。結(jié)合文獻報道，本研究團隊認為Tan ⅡA可協(xié)同ATO促進Beclin-1、LC3-Ⅱ高表達，增強NB4細胞自噬活性，誘導自噬性死亡，從而發(fā)揮化療增敏效果。

本實驗證實，Tan ⅡA在體外有抑制人急性早幼粒白血病NB4細胞株增殖的作用，并對ATO有化療增敏作用，其機制可能與上調(diào)自噬特異性蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡特異性蛋白Caspase-3的表達有關(guān)，通過誘導自噬性死亡和凋亡共同促進細胞死亡，但具體的分子機制和調(diào)控機制仍有待進一步研究闡明。Tan ⅡA有望成為一種有前途的、高效低毒的抗腫瘤增敏藥物，為白血病的治療提供新的策略。