□ 葛曉曉 彭雪琦 江蘇省理化測(cè)試中心

赭曲霉毒素（ochratoxin）是一種天然存在的毒性污染物質(zhì)，有A、B、C與D 4種，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A,簡(jiǎn)稱(chēng)OTA）毒性最大[1]。赭曲霉毒素廣泛存在于糧食、豆類(lèi)、咖啡豆和飼料等，在存儲(chǔ)及運(yùn)輸方式不當(dāng)時(shí)，食品發(fā)生霉變可產(chǎn)生。OTA對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)的免疫系統(tǒng)有顯著性的破壞作用，對(duì)動(dòng)物及人類(lèi)腎臟、肝臟等具有致癌、致畸等作用[2—3]，所以食品中OTA含量檢測(cè)至關(guān)重要。

目前，我國(guó)對(duì)于豆類(lèi)及其制品中赭曲霉毒素A的定量檢測(cè)方法主要包括液相色譜（HPLC）[4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC—MS/MS）法[5]。HPLC 法采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，準(zhǔn)確性高。LC—MS/MS法具有更高的靈敏度和高效性，但實(shí)驗(yàn)前處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾較大。常用的凈化方法有免疫親和柱凈化[6]、離子交換固相萃取柱凈化[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]等。此外，目前文獻(xiàn)中對(duì)于豆類(lèi)及其制品中赭曲霉毒素A測(cè)定技術(shù)的研究較少。本研究基于LC—MS/MS檢測(cè)技術(shù)，在現(xiàn)有檢測(cè)方法基礎(chǔ)上對(duì)豆類(lèi)及其制品的赭曲霉毒素A提取及測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化，研究成果可為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)赭曲霉毒素A提供可靠依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent1290—6470 液相色譜 —三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)，安捷倫公司）；BAS224S—CW萬(wàn)分之一天平（賽多利斯）；KQ—400KDE高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL—18高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；RE—2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；SHB—IIIA循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；AutoVapS60氮吹濃縮儀（美國(guó)ATR）。

赭曲霉毒素 A 標(biāo)準(zhǔn)品（10 μg/L，Pribolab Pte Ltd），氯化鈉，甲醇（AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)）；甲醇，乙腈，甲酸（HPLC級(jí)，美國(guó)Honeywell公司）；免疫親和柱（Romer Labs）。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱Waters Sunfire C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 色 譜 柱 溫 度40 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。流動(dòng)相 A 為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0～0.20 min（80% A+20% B），0.20 ～ 0.50 min（30%A+70%B），0.80 ～ 0.90 min（80%A+20%B），0.90～2.50 min（80%A+20%B），流速0.5 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜掃描采集方法MRM，質(zhì)譜離子源為ESI電離源，采用正離子模式，其他質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

樣品粉碎，過(guò)篩，稱(chēng)取25 g（精確到0.001 g）于100 mL容量瓶中，加入5 g氯化鈉，加入60%乙腈溶液稀釋定容，超聲20 min，取部分溶液過(guò)濾，離心，取上清液。精密量取濾液10 mL于離心管中，加入40 mL水混勻，取10 mL過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)免疫親和柱，用5 mL甲醇洗脫，氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇溶解，待測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制

溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確移取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶，稀釋定容。分別移取5、10、20、50、100 μL 與 200 μL， 于 6 個(gè)10 mL容量瓶，用甲醇溶液稀釋定容，配制成濃度為0.5、1、2、5、10 μg/L和20 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理優(yōu)化

本次檢測(cè)參考GB 5009.96—2016，對(duì)萃取溶劑進(jìn)行了優(yōu)化，研究了甲醇、乙腈、80%甲醇、80%乙腈、60%乙腈的提取效果。結(jié)果表明，加入少量水有助于回收率的提高，但水過(guò)多，會(huì)使提取過(guò)程中混入更多植物蛋白等水溶性物質(zhì)。因此結(jié)合文獻(xiàn)[9]及標(biāo)準(zhǔn)[10]，后續(xù)試驗(yàn)選擇60%乙腈為提取溶劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)考察了Waters Sunf i re C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），Agilent Poroshell 120 EC—C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）兩種不同色譜柱對(duì)赭曲霉毒素A的測(cè)定效果。結(jié)果表明，在同等條件下，采用C18短柱，響應(yīng)值更高，所以采用C18短柱。試驗(yàn)分別采用甲醇—水，乙腈—水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A峰形較寬。由于赭曲霉毒素 A 含有氨基（—NH2）及氯（—Cl），所以在水相中加入0.1%甲酸，可促進(jìn)離子化效應(yīng)，以提高響應(yīng)。采用1%甲酸—甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，甲醇出峰時(shí)間更早，不利于雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的分離。所以試驗(yàn)采用0.1%甲酸水—乙腈作為流動(dòng)相，分離效果好。

2.3 方法學(xué)研究

取陰性空白樣，按相同前處理方法制得其空白基質(zhì)溶液，配制20 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。同時(shí)用甲醇配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)平行測(cè)定6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的108%，說(shuō)明經(jīng)過(guò)前處理后，凈化程度較高，基質(zhì)效應(yīng)影響較小。在后續(xù)試驗(yàn)中，可采用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

試驗(yàn)采用甲醇配制質(zhì)量濃度為0.5～20 μg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照優(yōu)化后的色譜、質(zhì)譜條件依次進(jìn)行測(cè)定。對(duì)質(zhì)量濃度（x，μg/L）和定量離子對(duì)峰面積（y）進(jìn)行線(xiàn)性擬合。擬合結(jié)果表明在0.5～20 μg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性方程為y=14 073.8x—902.9（R2=0.999 4）。 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，以信噪比S/N≥10確定定量限（LOQ）為1 μg/kg，逐級(jí)稀釋?zhuān)孕旁氡萐/N≥3確定檢出限（LOD）為 0.3 μg/kg。GB 2761—2017[11]規(guī) 定豆類(lèi)及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg，所以定量限滿(mǎn)足檢測(cè)需求。

選擇多種陰性樣品進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)隨機(jī)選擇了3種食品—黃豆、豆干、綠豆。添加水平分別為1、2、10 μg/kg，按本文方法進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定，平行測(cè)定6次。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，在表中3種食品中，赭曲霉毒素A的平均回收率為85.6%～106.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.96%～3.5%，符合檢測(cè)要求。

2.4 樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽檢20份豆類(lèi)及其制品食品，采用本文建立的方法測(cè)定其中赭曲霉毒素A的含量，均為陰性。采用GB 5009.96—2016第一法復(fù)核，結(jié)果一致。說(shuō)明本文方法可行。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的豆類(lèi)及其制品中赭曲霉毒素A含量的檢測(cè)方法，該方法以80%甲醇提取結(jié)合免疫親和柱凈化，前處理過(guò)程便捷、快速，且檢測(cè)結(jié)果精確，該方法可為檢測(cè)豆類(lèi)及其制品提供新的選擇。

表2 赭曲霉毒素A的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）