盧 偉， 韓 釗， 蹇興亮， Zhou Ji， 姜 東， 丁艷鋒

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備工程實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210031 2. John Innes Centre， Earlham Institute， Norwich Research Park， Norwich， NR4 7UH， UK 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物表型組學(xué)交叉研究中心， 江蘇 南京 210014

引 言

全球人口持續(xù)增長(zhǎng)， 預(yù)計(jì)到2050年， 人類對(duì)糧食作物的需求將翻一番[1]。 玉米是世界上三大谷物之一， 不僅可以用于直接食用， 還可以用作動(dòng)物飼料和制造玉米乙醇、 玉米油、 玉米淀粉和玉米糖漿， 而提高玉米的產(chǎn)量首先需要篩選優(yōu)質(zhì)的種子。 玉米種子老化劣變后的重要表型信息之一是玉米根系發(fā)育的遲緩。 根系具有吸收水分及土壤中植物所需的礦物質(zhì)、 固持植物體等功能[2]， 是植物體生長(zhǎng)的重要養(yǎng)分來源， 因此通過玉米根系表型進(jìn)行玉米種質(zhì)的評(píng)價(jià)具有重要意義[3]。

土壤中根系表型無損檢測(cè)由于受到土壤的影響， 一直是近年來研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 目前， 針對(duì)土壤中根系表型檢測(cè)， 最傳統(tǒng)且最直接的方法為挖掘法， 又分為直接挖掘法和保護(hù)挖掘法[4]， 挖掘法會(huì)破壞根系原有的三維形態(tài)和生長(zhǎng)環(huán)境， 對(duì)根系有較為嚴(yán)重的損傷和影響， 還需清洗等復(fù)雜后續(xù)處理， 費(fèi)工費(fèi)時(shí)。 隨后出現(xiàn)的土壤核、 土柱管等方法可保留土壤根系原狀， 但存在勞動(dòng)密集、 耗時(shí)、 有損的問題。 根管法可對(duì)作物根系表型進(jìn)行原位檢測(cè)， 但僅能檢測(cè)作物根系的部分表型信息， 且根管法本身就對(duì)作物生長(zhǎng)存在一定的影響。 為實(shí)現(xiàn)根系表型信息的原位、 無損探測(cè)， 提出了水培法、 凝膠培養(yǎng)法[5]等， 借助三維掃描和成像技術(shù)[6]對(duì)根系進(jìn)行全局檢測(cè)， 具有較高精度， 但人工培養(yǎng)基與土壤基質(zhì)有本質(zhì)差別， 難以反映作物在土壤中的根系表型情況。

近年來， 核磁共振成像技術(shù)與X射線斷層掃描[7]被應(yīng)用于根系表型研究， 可對(duì)土壤中根系的表型信息進(jìn)行快速、 精確測(cè)量， 但儀器價(jià)格昂貴且長(zhǎng)期測(cè)量對(duì)作物根系具有一定的影響和傷害。 為實(shí)現(xiàn)根系圖像盡可能多的信息采集， 扁平透明的培養(yǎng)皿被用于根系表型成像研究[8]， 其成本較低且檢測(cè)速度快， 可應(yīng)用于作物根系表型的高通量檢測(cè)[9]， 是根系容易受到土壤的遮擋造成根系圖像斷裂和不完整。 但總體來看， 基于圖像的根系表型檢測(cè)技術(shù)具有低成本和高速度的優(yōu)勢(shì)， 適用于作物根系表型檢測(cè)的廣泛應(yīng)用。

紅外成像技術(shù)由于可以檢測(cè)不同物質(zhì)的溫度和熱學(xué)特性， 廣泛應(yīng)用于工業(yè)質(zhì)檢、 輔助醫(yī)療[10]、 食品檢測(cè)等領(lǐng)域[11]， 在農(nóng)業(yè)方面[12]， Leinonen等利用熱成像儀獲取干旱脅迫下葡萄樹的冠層溫度從而估測(cè)氣孔導(dǎo)度， 并通過熱紅外成像檢測(cè)早期侵染性病害等。

本工作根據(jù)水與泥土比熱容具有較大差異的特點(diǎn)， 首先設(shè)計(jì)雙層圓柱形培養(yǎng)裝置使得根系貼壁生長(zhǎng)以獲取較完整的根系直觀圖像； 再采用熱沖激結(jié)合熱紅外成像方法獲取玉米根系的增強(qiáng)圖像； 最后通過端點(diǎn)連接算法進(jìn)行根系的修復(fù)， 得到較為清晰完整的根系熱紅外圖像， 并基于根系熱紅外圖像表型信息進(jìn)行不同老化程度玉米種子的根系發(fā)育比較研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 熱紅外成像檢測(cè)

1.1.1 熱紅外圖像采集裝置

熱紅外成像系統(tǒng)包括熱紅外成像儀、 移動(dòng)手機(jī)等硬件裝置。 實(shí)驗(yàn)選用SEEK熱紅外成像儀(型號(hào)： COMPACT PRO)， 分辨率為320*240， 在工作波長(zhǎng)范圍為7.5～14 μm， 測(cè)溫范圍為-40～330 ℃。

1.1.2 熱紅外成像檢測(cè)方法

熱紅外成像是一種無損檢測(cè)技術(shù)， 比0.78 μm長(zhǎng)的電磁波位于可見光光譜紅色以外， 稱為紅外線， 其中波長(zhǎng)為2.0～1 000 μm的部分稱為熱紅外線。 自然界中一切物體都可以輻射紅外線， 因此利用探測(cè)儀測(cè)量目標(biāo)本身與背景間的紅外線差(溫差)可以得根土清晰的熱紅外線圖像。 干土壤的比熱容為0.84 J·(kg·℃)-1， 水的比熱容為4.2 J·(kg·℃)-1。 根據(jù)土壤與根系比熱容的差異， 即水的吸熱和散熱能力比土壤好， 采集圖像時(shí)使用滴管沿著玉米莖滴灌自來水， 由于土壤與根系之間有較大縫隙， 土壤本身壓實(shí)度較高， 水會(huì)沿根系走向流動(dòng)且主要集中在根系周圍。 在空氣加熱激勵(lì)時(shí)， 流動(dòng)水吸熱能力更強(qiáng)， 根系周圍會(huì)明顯比土壤溫度低， 溫度分布不同使得熱成像圖像中植物根系與土壤有明顯的區(qū)分； 另外培養(yǎng)裝置選擇高純石英玻璃， 材質(zhì)耐熱且熱紅外成像儀可透過容器壁采集熱紅外圖像。

1.2 圖像預(yù)處理

依次采用小波包去噪、 二值化、 膨脹以及圖像細(xì)化等預(yù)處理方法， 實(shí)現(xiàn)熱紅外圖像噪聲的濾除和玉米根系圖像微小斷點(diǎn)的連接。 并通過細(xì)化算法抽出根系熱紅外圖像的骨架(如圖1所示)。

圖1 根系熱紅外圖像采集

1.3 端點(diǎn)判定

經(jīng)預(yù)處理后根系圖像中玉米根系像素點(diǎn)為1， 土壤像素點(diǎn)為0。 先檢測(cè)每個(gè)根系像素點(diǎn)周圍的8個(gè)像素， 根據(jù)判定條件， 辨別端點(diǎn)和分叉點(diǎn)。 判定規(guī)則如圖2。

圖2 端點(diǎn)和交叉點(diǎn)判定規(guī)則

端點(diǎn)判定規(guī)則： 待定像素點(diǎn)周圍八個(gè)方向的像素點(diǎn)有且僅有一個(gè)像素為1， 則判為端點(diǎn)。

交叉點(diǎn)判定規(guī)則： 待定像素點(diǎn)周圍的八個(gè)方向上像素點(diǎn)為1的點(diǎn)與中心點(diǎn)連線的最大夾角小于135°， 則判為交叉點(diǎn)。

1.4 最佳匹配對(duì)確定

在所有端點(diǎn)和交叉點(diǎn)確定后， 選取一端點(diǎn)并分別測(cè)量該點(diǎn)與其他所有點(diǎn)的歐式距離， 選擇與該點(diǎn)最近歐氏距離dmin的點(diǎn)為最佳匹配點(diǎn)， 兩者形成最佳匹配對(duì)。 以最佳匹配對(duì)兩點(diǎn)連線反方向分別外延dmin/2， 以此連接線為中心、dmin為寬度標(biāo)記綠色矩形框用于后續(xù)端點(diǎn)連接， 如圖3所示。

圖3 最佳匹配對(duì)修復(fù)區(qū)域

1.5 Criminisi改進(jìn)算法

1.5.1 優(yōu)先權(quán)計(jì)算

計(jì)算優(yōu)先權(quán)是整個(gè)算法的關(guān)鍵， 其目的是決定圖像的修補(bǔ)順序， 令圖像的線性結(jié)構(gòu)得到傳播， 使得邊界信息互相連通。 優(yōu)先權(quán)計(jì)算由C(p)和D(p)兩項(xiàng)決定， 其中C(p)為以p為中心的已知像素所占比重；D(p)是邊界在p處的梯度法向量np與完好區(qū)域的邊緣梯度向量的乘積。 針對(duì)傳統(tǒng)Criminisi算法修復(fù)過程中C(p)急劇下降的問題引入影響因子γ， 服從式(1)， 見圖4

γ→γ(x)=Z(i)γ∈[0，1]

(1)

式(1)中，Z(i)為對(duì)數(shù)函數(shù)。

改進(jìn)后的置信度公式為式(2)

P=γD(p)+(1-γ)C(p)

(2)

圖4 Criminisi算法符號(hào)示意圖

1.5.2 搜索匹配塊

當(dāng)目標(biāo)區(qū)域邊界上所有修復(fù)塊的優(yōu)先級(jí)都計(jì)算完成后， 系統(tǒng)采用隨機(jī)搜索、 選取最佳匹配模板Ψp。 首先利用SSD原則計(jì)算區(qū)塊內(nèi)像素之間的顏色差距， 如式(3)所示

(3)

式(3)中， R， G， B分別表示目標(biāo)塊內(nèi)像素的RGB三原色。 通過公式尋找顏色差距最小的像素塊， 確定最佳匹配方式的大范圍， 并不斷縮小范圍， 找到與最大優(yōu)先權(quán)值的修復(fù)塊差距最小的像素塊， 即為最相似匹配塊， 使用其對(duì)修復(fù)塊進(jìn)行更新， 如式(4)所示

(4)

1.5.3 置信度的更新

經(jīng)過最佳匹配塊的填充， 待修補(bǔ)區(qū)域參數(shù)由未知變?yōu)橐阎?該區(qū)域的置信度得到更新。 成為接下來修復(fù)的依據(jù)， 即一次修復(fù)完成。 更新公式為式(5)

C(p)=C(q)

(5)

此時(shí)， 邊界重新劃分， 并重復(fù)1.5.1—1.5.3步驟， 直到目標(biāo)區(qū)域被填充完畢后輸出圖像。

整體算法流程如圖5所示。

圖5 根系熱紅外圖像修補(bǔ)算法流程圖

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料和設(shè)備

2.1.1 玉米種子老化處理

將玉米種子置于紗網(wǎng)袋中， 薄層平鋪放于老化箱中網(wǎng)架上， 以相對(duì)濕度90%、 溫度40 ℃的條件進(jìn)行人工加速老化處理， 老化處理時(shí)間分別為0(對(duì)照)， 1， 3和6 d的處理， 老化結(jié)束后將玉米種子取出， 風(fēng)干至原質(zhì)量。

2.1.2 環(huán)形植物培養(yǎng)裝置

基于以往研究、 并結(jié)合植物根系空間圓柱伸展特性， 采用雙圓柱環(huán)形透明結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)裝置。 將兩個(gè)半徑不同但高度相同的石英玻璃圓筒同心嵌套， 底部與一打有漏水孔的底座固裝， 兩圓柱夾層裝入土壤并種植不同老化時(shí)間的玉米種子。 此圓環(huán)形結(jié)構(gòu)兼顧玉米根系的構(gòu)型特征同時(shí)可迫使根系貼近玻璃， 便于成像。

2.2 熱紅外圖像采集過程

2.2.1 種子預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)選用2018年收獲、 發(fā)芽率在85%以上蘇玉41玉米種子， 玉米種子用70%(V/V)乙醇沖洗30 s， 移入5%次氯酸鈉溶液中靜置10 min， 再用無菌水沖洗三次后浸泡， 隨后再浸于40 ℃的水中12 h， 最后種植于環(huán)形培養(yǎng)裝置中。 種子培養(yǎng)在25～28 ℃的溫室內(nèi)， 培養(yǎng)過程中平均5 d澆一次水。

2.2.2 采集過程

將植物容器置于20 ℃的房間內(nèi)， 使用滴管向玉米莖處滴灌20 ℃自來水， 隨后通過350 ℃熱空氣立即加熱沖激3 s， 根系與土壤均勻受熱， 在加熱同時(shí)利用熱紅外成像儀拍攝根系隨溫度變化情況， 截取最優(yōu)效果圖， 即得到根系熱紅外圖像。

2.3 玉米根系表型信息分析

種子幼苗根系表型信息能直觀反映種子活力， 與谷物產(chǎn)量具有顯著相關(guān)性[13]。 利用所提出的Criminisi改進(jìn)算法增強(qiáng)并提取玉米根系熱紅外圖像中的根系表型參數(shù)， 根系修復(fù)過程見圖6(a—h)， 總根數(shù)RTN(RootTotal Number)、 總根長(zhǎng)RTL(RootTotal Length)[14]， 進(jìn)行作物根系表型檢測(cè)分析。

老化0， 1和3 d的玉米種子分別種植在環(huán)形培養(yǎng)裝置里， 記錄生長(zhǎng)10 d的熱紅外圖像和彩色圖像， 提取根系表型參數(shù)如表1所示。

表1 熱紅外圖像、 彩色圖像與實(shí)際玉米根系表型參數(shù)對(duì)比

可見所提出的熱紅外圖像結(jié)合Criminisi改進(jìn)算法提取的根系信息的準(zhǔn)確性明顯高于彩色圖像提取的信息。 熱紅外圖像提取的RTN， RTL信息的準(zhǔn)確率可達(dá)99%以上， 而彩色圖像因土壤遮擋， 存在不連續(xù)根， 準(zhǔn)確率與土壤遮擋程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)， 當(dāng)遮擋程度大時(shí)， 長(zhǎng)根分段， RTN測(cè)量值增大， RTL測(cè)量值減小， 誤差值變大。

此外， 一段時(shí)間的玉米種子根系表型參數(shù)， 如RTN和RTL能夠直觀表達(dá)根系的生長(zhǎng)速度， 反映種子活性。 采用本方法， 連續(xù)記錄老化0， 1， 3和6 d的玉米種子生長(zhǎng)10 d的根系表型參數(shù)如圖7所示。 沒有老化活力高的種子其根系長(zhǎng)度與生長(zhǎng)時(shí)間呈近似線性關(guān)系， 老化1 d的種子其根系長(zhǎng)度與生長(zhǎng)時(shí)間線性度降低， 老化3和6 d的種子其根系長(zhǎng)度與生長(zhǎng)時(shí)間分別呈二次多項(xiàng)式和三次多項(xiàng)式關(guān)系。 總體上根系長(zhǎng)度與老化時(shí)間呈負(fù)相關(guān)， 且隨老化天數(shù)的增加生長(zhǎng)顯著遲緩。

圖6 玉米根系表型修復(fù)過程圖

不同老化天數(shù)的玉米種子根系數(shù)量與生長(zhǎng)天數(shù)的關(guān)系如圖8所示。 未老化的玉米種子根系數(shù)量與生長(zhǎng)天數(shù)之間均呈近似線性關(guān)系， 根數(shù)從第2 d開始持續(xù)增加。 老化1和3 d的玉米種子根數(shù)從第3 d開始增加， 總體趨勢(shì)相近， 但在第4 d時(shí)老化1 d的玉米種子根數(shù)增長(zhǎng)迅速， 明顯高于老化3 d的種子。 老化6 d的玉米種子根系數(shù)目從第4 d開始增加， 且后續(xù)增加緩慢。 總體看， 老化后的種子根系數(shù)目均少于未老化的種子。

圖7 不同老化程度種子幼苗熱紅外成像總根長(zhǎng)變化圖

圖8 不同老化程度的熱紅外成像圖根數(shù)目統(tǒng)計(jì)圖

3 結(jié)果與討論

土壤中根系的表型信息能夠直觀反映種子的活力， 但由于土壤難以透視， 作為高通量的機(jī)器視覺難以進(jìn)行土壤中根系的表型檢測(cè)。 本工作設(shè)計(jì)了狹窄環(huán)形圓筒有利于根系的貼壁生長(zhǎng)， 利用水與土壤比熱容差異較大的特性， 通過外部短時(shí)熱激勵(lì)產(chǎn)生溫差， 采用熱紅外成像能夠增強(qiáng)根系圖像信息， 采集到土壤遮蓋的部分根系， 通過Criminisi改進(jìn)算法能夠?qū)τ衩赘祱D像進(jìn)行修復(fù)， 提取更精確的根系表型信息。 采用脈沖熱紅外成像提取的玉米根系RTL和RTN表型參數(shù)比彩色圖像提取的參數(shù)精度提高約0.5%～10%。

不同老化程度種子的劣變程度不同， 在高溫高濕中長(zhǎng)時(shí)間暴露， 種子質(zhì)膜受損， 破壞種子質(zhì)膜的完整性[15]， 其發(fā)芽率、 發(fā)芽勢(shì)、 生活力、 種子活力均顯著下降[16]， 等位基因數(shù)、 有效基因數(shù)減少， 導(dǎo)致遺傳多樣性也有所下降。 本研究采用的熱紅外成像和根系修復(fù)方法， 對(duì)不同老化程度(0， 1， 3和6 d)的玉米種子其早期幼苗的根系發(fā)育進(jìn)行了研究， 表明種子老化1 d后其根系表型參數(shù)RTL和RTN未見明顯差異， 但老化3和6 d的種子其根系表型參數(shù)具有顯著差異， RTL減少20%～35%， RTN減少10%～55%， 反映了玉米種子長(zhǎng)時(shí)間老化后其活力顯著下降。 此外， 種子根系RTN參數(shù)對(duì)老化更為敏感， 更能夠直觀反映種子的活力水平， 老化1和3 d的種子發(fā)根與未老化種子相比均推遲1 d； 老化6 d的種子其發(fā)根則推遲2 d， 且后續(xù)根系發(fā)育一直遲緩。 根系發(fā)育的遲緩直接導(dǎo)致作物吸收水分以及各類礦物質(zhì)能力下降， 植物的抗逆性受損。

4 結(jié) 論

(1)根據(jù)水和土壤比熱容差異的特性， 提出通過脈沖加熱和熱紅外成像相結(jié)合進(jìn)行土壤中根系信息增強(qiáng)， 提出基于Criminisi改進(jìn)算法的玉米根系圖像斷根修復(fù)算法， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了所提方法的有效性。

(2)本文方法， 對(duì)不同活力(老化0， 1， 3和6 d)的玉米種子的早期根系發(fā)育進(jìn)行表型檢測(cè)， 表明玉米種子早期根系表型信息(RTL和RTN)可有效表達(dá)種子的活力水平。