劉燕德， 高 雪， 姜小剛， 高海根， 林曉東， 張 雨， 鄭藝蕾

華東交通大學機電與車輛工程學院， 光機電技術及應用研究所， 江西 南昌 330013

引 言

油茶是我國南方特有的食用油料樹種， 具有良好的生態(tài)經(jīng)濟效益。 目前， 產(chǎn)業(yè)面臨的最大問題是如何提高油茶種植區(qū)產(chǎn)量。 油茶產(chǎn)量與油茶樹生長的健康狀態(tài)密切相關， 所以檢測油茶病害是提高油茶產(chǎn)量的重要保障。 油茶炭疽病是長江流域以南各省油茶栽培區(qū)普遍發(fā)生的一種重要病害， 病害嚴重時會引起落果、 落蕾、 枝梢枯死， 甚至整株衰亡的現(xiàn)象[1]。 因此， 找到一種快速、 有效、 無損的油茶炭疽病檢測方法， 對油茶產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

油茶主要是大面積種植， 不可避免的會受到病害侵襲。 病害嚴重威脅著整個油茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟社會效益。 目前， 病害檢測成為了大量研究人員討論的熱點問題。 熊朝偉[2]、 楊婷[3]等根據(jù)分析油茶炭疽病病原菌， 檢測油茶炭疽病。 這種檢測方法雖然具有較高的精度和靈敏度， 但對試驗研究人員的技術要求高， 他們必須具備分析病菌能力、 且樣品制備復雜、 試驗產(chǎn)物對環(huán)境污染嚴重。 還有一些研究者嘗試著用無損檢測方法， 如伍南[1]等采用可見-近紅外光譜技術和高光譜技術檢測油茶炭疽病。

激光誘導擊穿光譜技術(laser-induced breakdown spectroscopy, LIBS)[4]是一種可同時檢測多元素的簡便、 快速、 無損分析技術， 被靈活地應用在農(nóng)業(yè)檢測方面[5]。 趙賢德等利用納米增強LIBS技術檢測蘋果表面農(nóng)藥殘留， 檢測到的毒死蜱農(nóng)藥檢測限最低為1.61 μg·cm-2(見本刊39卷7期)； Jull[6]等采用LIBS技術對新鮮牧草和干燥牧草的營養(yǎng)水平進行了預測， 結(jié)果表明LIBS可以用來評估新鮮牧場的營養(yǎng)水平； Shukla[7]等利用LIBS技術檢測了五種不同綠葉蔬菜中的礦物質(zhì)分布。 Wang[8]等采用LIBS和判別分析(DA)相結(jié)合的方法， 對6種茶葉進行了分析鑒定， 其平均正確識別率高達95.33%。

目前， LIBS在油茶病害檢測應用很少， 鑒于LIBS在眾多植物病害檢測方法中比較新穎和突出， 提出了基于LIBS的油茶炭疽病檢測方法。 油茶葉片的生長情況直接反映油茶樹及整個種植區(qū)油茶的健康程度。 以油茶健康葉片和感染炭疽病的葉片為研究對象， 研究健康葉片和感染炭疽病葉片的LIBS及其光譜響應。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

油茶的健康葉片和感染炭疽病的葉片在2019年6月江西省南昌市的油茶林分散的采集了具有代表的兩種葉片。 健康葉片指葉片表面光滑無任何病斑， 感染炭疽病葉片指黑褐色病斑的面積占總面積的1/4以上， 分別采摘100片。 由于天氣炎熱， 將采集的新鮮葉片裝入保鮮袋中， 并將其與冰袋放在一起帶回實驗室， 可以保證葉片的新鮮程度， 用于LIBS光譜采集實驗。 實驗過程： 首先， 用實驗室制備的去離子水反復沖洗葉片表面3次， 目的是去除油茶葉片表面上影響實驗結(jié)果的一些污漬； 然后， 用吸水紙擦干， 放置通風處靜置兩小時自然風干， 減少葉片表面水珠對LIBS的影響； 最后， 裝袋并分類標號。

1.2 LIBS設備

實驗采用的LIBS設備是海洋光學的MX2500+， 如圖1所示為LIBS系統(tǒng)原理圖。 Q開關Nd∶YAG激光器激發(fā)出脈沖寬度為納秒量級的較高能量激光， 經(jīng)反射后， 由透鏡聚焦到油茶葉片表面， 剝離葉片表面微量物質(zhì)形成等離子體， 由光纖收集后傳輸給5個通道的多通道光譜儀中， 然后通過光譜儀配套的MaxLIBS軟件設置參數(shù)， 進行元素的波長與信號強度的光譜采集。

圖1 LIBS系統(tǒng)原理圖

激光能量設置為50 mJ， 光譜儀的波長范圍為198.71～727.69 nm， 光學分辨率0.1 nm， 延遲時間設為2 μs。 每個樣本分散采集6個LIBS光譜數(shù)據(jù)值， 健康油茶葉片在避開葉脈處采集， 感染炭疽病的葉片在病斑周圍(患病初期)采集， 將每個葉片采集到的LIBS光譜數(shù)據(jù)求其平均值， 目的是減小誤差， 同時降低油茶葉片不平整對樣品的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

LIBS光譜信號受激光器激光能量的波動、 光譜儀分辨率的差異、 外部環(huán)境的差異以及樣品不均勻等因素影響[9]， 為了有效地消除或減弱這些干擾信息， 對LIBS光譜數(shù)據(jù)進行光譜預處理。 通過對比分析了Savitzky-Golay卷積平滑法、 一階導數(shù)和多元散射校正(MSC)三種光譜預處理方法， 最終發(fā)現(xiàn)MSC的預處理效果最好。

多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)主要應用于固體漫反射和漿狀物透(反)射光譜中， 目的是消除顆粒分布不均勻及顆粒大小產(chǎn)生的散射影響。 MSC算法是基于一組樣品的光譜陣進行運算的， 具體算法如式(1)

xMSC=(x-b)

(1)

其中，x和b是通過計算樣品的平均光譜， 并將x與進行線性回歸：x=b0， 用最小二乘法求得x和b的值。

根據(jù)大量學者的研究文獻和NIST(美國國家標準與技術研究院)的標準原子光譜數(shù)據(jù)庫， 預選光譜Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七條LIBS光譜為分析油茶炭疽病的譜線。 這些微量元素與油茶葉片組織有內(nèi)在的相關性， 即這些微量元素有可能區(qū)分出健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片。 采用軟件Unscrambler 9.7中的主成分分析法(principal component analysis， PCA)和偏最小二乘判別分析[10](partial least square discriminant analysis， PLS-DA)對LIBS光譜數(shù)據(jù)進行分類處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 葉片LIBS光譜特征分析

圖2為Si和Fe的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實線表示健康油茶葉片光譜。 在波長251.432和252.285 nm處分別觀察到Si和Fe的特征峰， 從圖中可以發(fā)現(xiàn)健康油茶葉片中Si的特征峰強度明顯大于感染炭疽病油茶葉片中Si的特征峰。 這種差異歸因于Si在植物生長過程中所起的作用： Si是油茶生長必需的營養(yǎng)成分， 可以促進植物生長， 提高產(chǎn)量和品質(zhì)； Si還具有抵抗病原菌侵襲植物的作用。 健康油茶樹中大量的Si元素起到抗病作用， 與之相反， 感染炭疽病的油茶葉片中Si含量低， 受炭疽病侵害。

圖3是Fe和Mn的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實線表示健康油茶葉片的光譜。 觀察到Fe和Mn譜線： Fe(Ⅰ)385.991 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm。 從Fe的三個特征峰可以明顯的觀察到， 健康油茶葉片中Fe的特征峰強度高于感染炭疽病油茶葉片中Fe的特征峰強度。 原因是Fe是形成葉綠素必須的微量元素， 健康油茶葉片中含有的大量Fe作用于細胞呼吸和代謝， 而感染炭疽病的油茶葉片的表面上出現(xiàn)病斑且病斑周圍呈淡黃色， 出現(xiàn)缺鐵變黃的癥狀。

圖2 油茶葉片在250～254 nm波長范圍內(nèi)Si和Fe的LIBS光譜

圖3 油茶葉片的Fe和Mn的LIBS光譜

圖4是Mn的LIBS光譜。 短劃線表示感染炭疽病的油茶葉片光譜， 實線表示健康油茶葉片的光譜。 從圖3和4中可以明顯地觀察到Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm的特征譜線。 同樣可以發(fā)現(xiàn)健康油茶葉片中Mn的特征峰強度明顯大于感染炭疽病油茶葉片中Mn的特征峰強度。 這是因為Mn是葉綠體的組成部分， 是維持葉綠體結(jié)構(gòu)所必需的微量元素， 當葉片嚴重缺錳時， 葉面會出現(xiàn)黑褐色細小斑點， 并逐漸擴大， 散布于整個葉片。 由感染炭疽病油茶葉片的外觀可推斷感染炭疽病的油茶葉片缺錳， 所以該葉片中Mn的特征峰強度比較低。

圖4 油茶葉片在278～282 nm波長范圍內(nèi)Mn的LIBS光譜

實驗過程中， 分別挑選了炭疽病病斑面積占葉片總面積比例不同的LIBS光譜圖如圖5所示。 A代表炭疽病病斑面積占總面積1/4以下的LIBS光譜， B代表病斑面積占總面積1/4～2/4的LIBS光譜， C代表病斑面積占總面積2/4～3/4的LIBS光譜， D代表病斑面積占總面積3/4以上的LIBS光譜。 從圖中可以清晰地發(fā)現(xiàn)葉片表面上病斑面積越小其對應的特征峰強度就越大， 其中病斑面積在1/4～2/4和2/4～3/4的LIBS光譜強度差異很小， 很難區(qū)分。 但從光譜的總體趨勢可以發(fā)現(xiàn)葉片LIBS光譜特征峰強度隨著病斑面積的增大而減小。

圖5 四種炭疽病病斑面積不同的LIBS光譜圖

綜合上述健康油茶葉片中Si， Fe和Mn的特征峰強度明顯高于感染炭疽病的油茶葉片中Si， Fe和Mn的特征峰強度。 且油茶葉片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信號強度與葉片的健康狀態(tài)呈線性關系， LIBS信號強度隨著葉片的病害狀態(tài)加重逐漸降低。 故選用Si(Ⅰ)251.432 nm， Fe(Ⅰ)252.285 nm， Fe(Ⅱ)259.837 nm， Fe(Ⅰ)385.991 nm， Mn(Ⅱ)260.568 nm， Mn(Ⅰ)279.482 nm和Mn(Ⅰ)280.108 nm七條特征光譜對油茶葉片的健康和感染炭疽病的兩種情況進行分析。

2.2 健康和染病的油茶葉片LIBS光譜的PCA分析

為了更清晰地區(qū)分健康和感染炭疽病的油茶葉片， 選用Si(251.432 nm)， Fe(252.285， 259.837和385.991 nm)， Mn(260.568， 279.482和280.108 nm)的特征峰進行PCA分類。 主成分個數(shù)設置為7個， 特征變量選取了七段光譜波段： 251.429 9～251.531 4， 252.241 4～252.342 7， 259.791 3～259.891 3， 385.957 7～386.044 3， 260.540 5～260.640 3， 279.398 2～279.494 3和280.070 1～280.166 0 nm。 由于選取數(shù)據(jù)的變量維數(shù)較多， 為了更好地從圖中判別兩種葉片光譜的差異性， 建立了三維的PCA分類模型如圖6所示， 其中PC1， PC2和PC3的貢獻率分別為80%， 12%和6%。 紅色圓代表健康油茶葉片， 藍色三角代表稈染炭疽病的油茶葉片， 從圖中可以清晰的觀察到PCA分類方法可以很好的對健康和感染炭疽病的油茶葉片進行分類， 其中有少數(shù)的葉片光譜區(qū)分的不是很明顯， 可能原因是感染炭疽病的葉片表面上患病面積較小， 屬于患病初期， 微量元素含量變化較小， 與健康油茶葉片中微量元素的含量比較接近。

圖6 健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片的PCA分析

2.3 基于偏最小二乘的油茶葉片健康狀態(tài)判別模型研究

使用122個樣品用于判別模型建立， 其中健康油茶葉片59個， 感染炭疽病的油茶葉片63個。 首先人為設定健康油茶樣品類別為2， 感染炭疽病的油茶樣品類別為-2， 然后按照3∶1的比例將油茶葉片隨機分為建模集和預測集兩部分， 建模集有92個樣品(健康葉片43個， 感染炭疽病葉片49個)， 預測集有30個樣品(健康葉片16個， 感染炭疽病的14個)。 如圖7所示， 在PLS-DA建模集模型中， 誤判樣品數(shù)為4個， 誤判率為4.3%； PLS-DA預測集模型中， 誤判樣品個數(shù)為3個， 誤判率為10%。 兩個判別模型的識別率都高于90%以上， 能夠較好的將健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片分類。

圖7 偏最小二乘判別分析模

3 結(jié) 論

分析了油茶葉片中的微量元素Si， Fe和Mn的LIBS信號特點， 得出的結(jié)論是： 這三種微量元素的LIBS信號的特征峰強度與油茶葉片感染炭疽病的等級(健康葉片為0級)具有相關性， 隨著等級的增加， LIBS信號特征峰強度逐漸降低。 另外， LIBS光譜線結(jié)合MSC光譜預處理方法和PCA分類方法對健康和感染炭疽病的油茶葉片進行分類， 可以很好地區(qū)分健康油茶葉片和感染炭疽病的油茶葉片。 進一步利用PLS-DA進行建模判別， 模型的識別率均高于90%以上， 也可以較好地區(qū)分油茶葉片的健康和染病兩種狀態(tài)。

研究顯示， 采用激光誘導擊穿光譜技術結(jié)合主成分分析、 偏最小二乘判別分析法識別油茶炭疽病葉片具有一定可行性。 為植物樣品檢測微量元素和營養(yǎng)元素提供了參考， 同時也為LIBS的應用提供了參考。