葉若柏， 吳珍紅， 繆曉青， *

1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002 2. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350002

引 言

人類(lèi)至今還未找到理想的抗腫瘤方法， 化學(xué)藥物抗腫瘤是重要的治療癌癥的方法之一[1]， 但由于其在治療中存在的不足， 使得在臨床應(yīng)用受到限制[2]。 很多多肽具有抗癌活性， 且無(wú)化療藥物的缺點(diǎn)[3]。 然而天然多肽不完美[4]， 設(shè)計(jì)低毒、 靶向腫瘤細(xì)胞、 抗癌活性強(qiáng)的多肽是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域[5]， 據(jù)此設(shè)計(jì)了陽(yáng)離子多肽(記： GPG， 其氨基酸序列為GRGDSPKFLHSAKKFGKAFPAVLKVLTTG)[6]， 探討對(duì)多肽(GPG)進(jìn)行體內(nèi)性能評(píng)價(jià)的方法。

傳統(tǒng)一般只對(duì)多肽活性進(jìn)行體外評(píng)價(jià)[7]， 然而生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜， 對(duì)多肽在體內(nèi)活性影響很大， 導(dǎo)致多肽大多被開(kāi)發(fā)成用于體表的臨床藥物[8]。 具有快捷、 選擇性好， 且靈敏度高的分子熒光光譜技術(shù)已應(yīng)用到很多研究領(lǐng)域[9]， 用綠色熒光蛋白(如EGFP)轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建荷瘤小鼠模型[10]， 在小動(dòng)物活體成像儀上可以評(píng)價(jià)藥物的藥效[11]。 用成像儀跟蹤被熒光染料(如： Cy7)標(biāo)記的藥物在荷瘤模型上的行蹤， 可以評(píng)價(jià)藥物的靶向性[12]， 但上述兩種單報(bào)告基團(tuán)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒荒芡瑫r(shí)反映靶向藥物靶向至腫瘤腫塊后， 形成的對(duì)腫瘤腫塊包覆物的大小與形狀及由綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞所呈現(xiàn)的腫瘤腫塊本身的大小和形狀， 因此無(wú)法比較被包覆物與腫瘤腫塊的大小與形狀， 從而無(wú)法評(píng)價(jià)靶向物對(duì)靶標(biāo)的包覆程度。 靶向腫瘤細(xì)胞多肽對(duì)被靶腫瘤腫塊的包覆程度決定了靶向肽對(duì)腫瘤細(xì)胞膜的作用面積， 其直接影響靶向肽的藥效[13]。 且用單報(bào)告基團(tuán)模型評(píng)價(jià)藥物靶向性及藥效時(shí)， 一般使用不同的實(shí)驗(yàn)小鼠模型， 浪費(fèi)了資源與時(shí)間。

探討在同一小鼠體內(nèi)構(gòu)建基于雙報(bào)告基團(tuán)的熒光光譜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?在成像儀上監(jiān)測(cè)靶向肽對(duì)被靶腫瘤腫塊的包覆狀況， 克服傳統(tǒng)方法只能評(píng)價(jià)靶向肽靶向功能的弊端， 對(duì)多肽的作用機(jī)理進(jìn)行更深入研究； 研究?jī)H消耗一組荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?可連續(xù)對(duì)多肽在體內(nèi)的靶向性、 包覆腫瘤腫塊狀況、 抗腫瘤藥效和在體內(nèi)分布及代謝情況進(jìn)行簡(jiǎn)單、 快捷的分析， 節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本， 為設(shè)計(jì)性能更優(yōu)的抗癌肽提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、 藥品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小動(dòng)物活體成像儀(IBCX.Scientia)； Cy7購(gòu)自Lumiproble； 熒光染料Cy7標(biāo)記的GPG(記： Cy7-GPG， Ex=750 nm)， 含量96.2%， 上海生工公司加工； 綠色熒光蛋白EGFP轉(zhuǎn)染的小鼠肝腫瘤細(xì)胞H22(記： H22-EGFP， Ex=488 nm)， 轉(zhuǎn)染率為99.73 %， 購(gòu)自武漢百翼生物有限公司； 實(shí)驗(yàn)鼠(清潔級(jí)， (15～20) g·只-1)向凱學(xué)科技公司(上海)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 H22-EGFP腫瘤細(xì)胞移植瘤模型建立

取濃度為1×107個(gè)·mL-1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H22-EGFP懸浮液接種于小鼠背部(0.5 mL·只-1)， 12 d后， 用成像儀(Ex=488 nm)觀察到鼠背部形成直徑約(0.6～0.8) cm的腫瘤腫塊， 腫塊熒光光子數(shù)達(dá)(8.12±0.233)×106Photons·(s·cm2)-1(單位下同), 表明荷瘤模型建立成功。

1.3 GPG體內(nèi)靶向性、 包覆狀況、 藥效及分布實(shí)驗(yàn)

靶向性實(shí)驗(yàn)： 實(shí)驗(yàn)組由5只模型鼠組成， 尾靜脈注射濃度為1 mg·L-1的Cy7-GPG(0.1 mL·只-1)。 同法建立注射Cy7的對(duì)照組。 在不同檢測(cè)時(shí)點(diǎn)前6 h， 全部禁食， 到時(shí)點(diǎn)麻醉， 用成像儀(Ex=750 nm)錄得它們的熒光圖片， 在各組熒光圖片腫瘤區(qū)勾畫(huà)出感興趣區(qū)， 錄得它們的熒光光子數(shù)， 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至48 h結(jié)束。 表1為部分不同時(shí)點(diǎn)各組熒光光子數(shù)平均值。 圖1(a)為在不同時(shí)點(diǎn)上實(shí)驗(yàn)組中一只鼠的熒光圖片， 圖1(b)為對(duì)照組的圖片。

表1 不同時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組感興趣區(qū)熒光光子數(shù)

圖1 不同時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組(a)與對(duì)照組(b)小鼠體內(nèi)熒光分布

包覆狀況實(shí)驗(yàn)： 當(dāng)上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)入第24 h測(cè)定時(shí)點(diǎn)時(shí)， 先將Cy7-GPG實(shí)驗(yàn)組鼠進(jìn)行本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 任取其中一只鼠， 用成像儀分別在488和750 nm激發(fā)波長(zhǎng)下， 錄得腫瘤區(qū)熒光圖2(a)和圖2(b)， 并以圖2(a)中的A， B和C為感興趣區(qū)， 錄得它們的熒光光子數(shù)， 以圖2(b)中的D， E和F為感興趣區(qū)， 錄得它們的熒光光子數(shù)。

圖2 同一腫瘤腫塊在488 nm(a)和750 nm(b)下熒光圖

體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)： 本項(xiàng)試驗(yàn)由A， B， C和D四組組成。 A組： 荷瘤空白對(duì)照組; C組： 由原靶向?qū)嶒?yàn)中5只注射Cy7-GPG實(shí)驗(yàn)鼠組成， 在靶向?qū)嶒?yàn)結(jié)束后的第2天用于本組實(shí)驗(yàn); 為比較GPG的藥效還設(shè)置了B和D兩實(shí)驗(yàn)組， A， B和D各組均5只模型鼠。 各實(shí)驗(yàn)組每2 d從尾靜脈注射藥劑一次， B： 環(huán)磷酰胺(CTX， 1.44 mg·mL-1， 0.5 mL·只-1)； C： GPG(100 μmol·L-1， 0.5 mL·只-1)； D： (CTX 1.44 mg·mL-1， 0.25 mL·只-1； GPG 100 μmol·L-1， 0.5 mL·只-1)。 全部鼠在每次給藥前6 h禁食、 到時(shí)點(diǎn)麻醉， 先用成像儀錄得它們的熒光圖片(Ex=488 nm波長(zhǎng)激發(fā)下)， 后給藥。 在各鼠熒光圖片腫瘤上的感興趣區(qū)讀得它們各時(shí)點(diǎn)上的熒光光子數(shù)， 各組部分時(shí)點(diǎn)熒光光子數(shù)平均值見(jiàn)表2， 圖3為各組任一只鼠在用藥2和48 d時(shí)錄得的熒光圖片。 實(shí)驗(yàn)中每天記錄小鼠的生活狀況。

表2 不同時(shí)點(diǎn)各組小鼠腫瘤上感興趣區(qū)的熒光光子數(shù)

圖3 A， B， C和D組小鼠給藥2 d與48 d熒光圖

GPG在體內(nèi)臟器的分布及代謝實(shí)驗(yàn)： 將藥效實(shí)驗(yàn)時(shí)的C組全部小鼠， 在藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)束3天后用于本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)， 從尾靜脈注射Cy7-GPG(1 mg·L-1, 0.1 mL·只-1)， 48 h后處死小鼠， 取出主要內(nèi)臟及腫瘤腫塊， 在成像儀上(Ex=750 nm)測(cè)得它們的熒光光子數(shù)， 結(jié)果如圖4所示。

圖4 小鼠體內(nèi)各臟器及腫瘤的熒光光子數(shù)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS19.0軟件處理數(shù)據(jù)，p<0.05， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 GPG對(duì)腫瘤的靶向性

Cy7是熒光染料， 根據(jù)熒光強(qiáng)度的線性分布理論， 其由低到高按“紫→藍(lán)→綠→黃→紅→橙”的顏色依序變化， 由圖1(a)可見(jiàn)， 實(shí)驗(yàn)組注射Cy7-GPG后， 隨著時(shí)間推移， 橙色熒光向小鼠腫瘤區(qū)聚集， 到24 h時(shí)橙色熒光全部聚集到腫瘤上， 體內(nèi)其他部位沒(méi)有發(fā)現(xiàn)橙色熒光聚集。 表1示出， 隨著Cy7-GPG向腫瘤聚集過(guò)程， 小鼠體內(nèi)腫瘤處熒光光子數(shù)不斷增加， 到第24 h達(dá)最大值， 然后又逐漸下降。 此間對(duì)照組圖1(b)小鼠體內(nèi)腫瘤上顏色及表1示出的小鼠腫瘤處熒光光子數(shù)均無(wú)明顯變化， 表明GPG有較強(qiáng)的靶向性。

2.2 GPG對(duì)腫瘤腫塊包覆的狀況

H22-EGFP的轉(zhuǎn)染率高達(dá)99.73%。 生物之所以發(fā)光是基于活細(xì)胞環(huán)境的酶促反應(yīng)， 因此圖2(a)中腫瘤腫塊的大小與形狀是H22-EGFP活細(xì)胞本身呈現(xiàn)的。 圖2(b)中在腫瘤腫塊位置處所呈現(xiàn)的形狀是Cy7-GPG靶向至腫瘤腫塊上， 包覆了腫瘤腫塊后呈現(xiàn)的包覆物實(shí)際大小與形狀， 比較圖2(a)與圖2(b)可見(jiàn)它們的大小與形狀一致， 腫瘤的大小與形狀相當(dāng)于包覆物標(biāo)示出的腫瘤腫塊大小與形狀， 說(shuō)明GPG對(duì)腫瘤包覆程度很高。 該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯僖浦擦瞿Ｐ停?腫瘤長(zhǎng)在淺表層， 腫瘤背面的生長(zhǎng)環(huán)境與正面基本一致， 故Cy7-GPG在腫瘤背面上的包覆程度也是很高的， 即靶向至腫瘤的多肽對(duì)腫瘤的作用面積很大。 一般認(rèn)為多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞膜的作用是決定藥效的關(guān)鍵因素[13]， 因此， 了解靶向肽對(duì)腫瘤的包覆程度是很重要的。

H22-EGFP和Cy7-GPG均帶有熒光基團(tuán)， 它們的密度大之處， 熒光強(qiáng)度強(qiáng)。 圖2(a)中腫瘤上H22-EGFP發(fā)射出的熒光顏色深淺不同， 腫塊上感興趣區(qū)A， B和C處所錄熒光光子數(shù)分別為(85.6±8.47)×105， (83.9±7.98)×104， (77.1±7.29)×104， A與B， A與C的熒光光子數(shù)差異顯著， 表明腫瘤腫塊上活的腫瘤細(xì)胞密度分布是不均勻的。 圖2(b)中包覆在腫瘤腫塊上Cy7-GPG熒光顏色深淺也不同， 前述表明小鼠體內(nèi)腫瘤腫塊大小與形狀與包覆物是一致的。 選取圖2(b)包覆物上與圖2(a)腫瘤腫塊上A， B和C位置相對(duì)應(yīng)的D， E和F為感興趣區(qū)， 錄得它們的熒光光子數(shù)分別為(44.5±6.69)×107， (30.2±5.96)×106， (21.9±4.99)×106， D與E， D與F由Cy7-GPG發(fā)射出的熒光光子數(shù)差異也顯著， 這些變化規(guī)律與圖2(a)一致， 表明腫瘤腫塊上活的腫瘤細(xì)胞密度大的區(qū)域， Cy7-GPG的濃度也高， 熒光強(qiáng)度也強(qiáng)， 反之相反。 GPG序列中含有整合素ανβ3受體的配體RGD肽鏈， 其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有靶向性[14], 觀察靶向在腫瘤腫塊上的Cy7-GPG熒光光子數(shù)的變化， 有助于判斷靶向肽是否有效地殺死活的腫瘤細(xì)胞， 明確這一點(diǎn)對(duì)研究抗癌藥物的療效很有意義。 因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法是通過(guò)在小鼠體內(nèi)建立轉(zhuǎn)染了熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞模型, 評(píng)價(jià)抗癌肽殺死活的癌細(xì)胞的能力[10-11]， 這種實(shí)驗(yàn)不可能在人體內(nèi)進(jìn)行, 人體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜， 模型的不同可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 因此該法具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.3 GPG體內(nèi)抗腫瘤活性

由圖3可見(jiàn)， 實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)照組A的腫瘤腫塊變大， 熒光顏色加深， 表2示出其熒光光子數(shù)不斷增強(qiáng)。 B， C和D組給藥后， 腫瘤均明顯減小， 熒光顏色變淺， 表2示出這些組腫瘤熒光光子數(shù)明顯減小， 表明實(shí)驗(yàn)各組藥效均較強(qiáng)。 從圖3中B和C組小鼠體內(nèi)腫塊變化大小和表2中它們熒光光子數(shù)的變化, 可見(jiàn)CTX的藥效與GPG相差不多， 但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中CTX組的小鼠生命狀況不斷惡化， 實(shí)驗(yàn)到第48天時(shí)， 小鼠食量與飲水量都很少， 基本不能動(dòng)， 這可能是化學(xué)類(lèi)藥物CTX對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞有毒副作用所致[2]。 GPG是陽(yáng)離子多肽， 其所帶凈正電荷可選擇性地對(duì)帶負(fù)電性的腫瘤細(xì)胞膜產(chǎn)生作用[3]， 且它的氨基酸序列中又嵌入了RGD， 因此對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的靶向性[14]。 由本文2.4可知， GPG主要分布并作用在腫瘤上， 基本不對(duì)其他主要臟器產(chǎn)生影響。 GPG組不僅藥效強(qiáng)， 而且該組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中表現(xiàn)出的自發(fā)活動(dòng)行為正常。 圖3和表2還表明， 在D組中GPG和CTX配合使用， 可收到比C組更好的抗癌效果， 降低了CTX用量， 對(duì)小鼠的傷害比B組弱很多， 綜上， GPG在體內(nèi)的藥效較理想。

2.4 GPG在體內(nèi)分布及代謝

為了排除小鼠體內(nèi)各種因素產(chǎn)生的背景干擾熒光分辨， 將小鼠處死， 取出內(nèi)臟及腫瘤腫塊， 測(cè)量它們的熒光光子數(shù)。 由圖4可見(jiàn)， GPG主要分布在腫瘤上， 其余絕大多數(shù)在肝、 腎被分解并排出體外， 基本不對(duì)其他主要臟器產(chǎn)生毒副作用， 這主要由于GPG靶向并作用于腫瘤， 導(dǎo)致了其在腫瘤上聚集[15]。

3 結(jié) 論

(1)本文構(gòu)建基于H22-EGFP與Cy7-GPG雙報(bào)告基團(tuán)熒光活體成像模型， 通過(guò)成像儀可以判斷靶向肽Cy7-GPG對(duì)腫瘤腫塊的包覆狀況， 克服了傳統(tǒng)方法只能評(píng)價(jià)其靶向功能的弊端， 對(duì)靶向肽進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)， 增進(jìn)對(duì)靶向肽在體內(nèi)作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)； 通過(guò)該模型監(jiān)測(cè)表明， 可由標(biāo)記了熒光染料的靶向肽(如本文Cy7-GPG)在腫瘤腫塊上熒光光子數(shù)的變化， 判斷靶向肽有效殺死活的腫瘤細(xì)胞的能力， 該結(jié)果有臨床應(yīng)用價(jià)值。

(2)僅用一組基于雙報(bào)告基團(tuán)熒光活體成像模型， 可代替使用不同的單報(bào)告基團(tuán)模型， 連續(xù)進(jìn)行多肽在體內(nèi)的靶向性、 對(duì)腫瘤腫塊覆蓋狀況、 藥效、 分布及代謝的監(jiān)測(cè)， 節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本， 簡(jiǎn)單快捷。

(3)對(duì)GPG在體內(nèi)的性能監(jiān)測(cè)表明其性能較好， 有應(yīng)用前景。