謝 晉，郭奧鈿，盧 闊，羅敏健,申洪杰

(華南理工大學(xué) 機(jī)械與汽車工程學(xué)院，廣東 廣州 510640;廣州迪澳生物科技有限公司，廣東 廣州 510663)

1 引 言

微流控芯片技術(shù)正在應(yīng)用于快速生物病毒檢測，促進(jìn)新興科技及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1]。通常，芯片材料選用陶瓷、硅質(zhì)材料、高聚物材料等，但加工機(jī)理和工藝都不同[2]。例如，光固化3D工藝制備快速檢測血型的微流控芯片，檢測時間約為3 min[3]，但其微流道尺度為毫米級。雖然YAG(Yttrium Aluminium Garnet)雷射在硅芯片上可制備出深寬均為150 μm的微流道，但表面不平整[4]。超快激光可在有機(jī)玻璃(Polymethyl Methacrylate,PMMA)上制備寬度20～90 μm的流道[5]，但其熱熔去除會使微流道結(jié)構(gòu)表面粗糙。這些物理加工方法會導(dǎo)致表面粗糙和結(jié)構(gòu)不規(guī)則，使得微流體流動困難，產(chǎn)業(yè)化過程中需要離心機(jī)等外加驅(qū)動。

在芯片加工和封裝方面，軟光刻法和紫外光鍵合可制作PMDS(Polydimethy lsiloxane)被動微混合器，其混合系數(shù)可達(dá)到60%[6-7]。而且，微流道陽模3D打印與PDMS倒模相結(jié)合，在非鍵合封裝條件下制備PDMS微流控芯片[8-9]。但是，芯片的微流道結(jié)構(gòu)精度難被控制。

在微液體流動機(jī)理方面，研究主要關(guān)注液滴生成與運(yùn)動、連續(xù)介質(zhì)流動等流體動力學(xué)[10]，但尚未詳細(xì)涉及微流道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。為了驅(qū)動微液滴，通過微陣列電極的電勢梯度改變其接觸角[11]，也有通過熱毛細(xì)管的熱梯度產(chǎn)生表面能梯度[12]。微流控芯片已經(jīng)被用于登革熱病毒檢測[13]。但是，這些微流動的實際應(yīng)用需要電場、加熱等外圍裝置。

在微流控芯片設(shè)計上，主要考慮Y型和S型混合流道，通過蠕動泵的負(fù)壓驅(qū)動芯片，在線檢測發(fā)酵的葡萄糖[14]。而且，設(shè)計濃度梯度的微流控芯片，快速篩選抗白念珠菌藥物[15]。設(shè)計聚苯乙烯聲學(xué)分離芯片，從含菌血液中分離40%～60%的細(xì)菌[16]。此外，圓臺形微孔陣列芯片可以在1 cm2內(nèi)配對約6 000個異型細(xì)胞對[17]。但是，尚未有自驅(qū)動的微流控芯片用于生物病毒檢測。

因此，依據(jù)微流道結(jié)構(gòu)的表面張力等，設(shè)計自驅(qū)動的微流控芯片，實現(xiàn)了無需外加離心力就可以快速檢測出病原體DNA。采用超硬金剛石微磨削技術(shù)，在石英玻璃表面加工出高精度的微V槽流道。著重研究微V槽微流道的表面粗糙度、尖端角度、梯度等拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)對自驅(qū)動性能的影響。最后，研制出用于布魯氏菌檢測的自驅(qū)動微流控芯片。

圖1 金剛石砂輪微尖端修整工藝Fig.1 Micro-tip truing process for diamond grinding wheel

2 微流道精密磨削工藝及技術(shù)

精密微磨削取決于工具尖端在位修整?；诙噍S數(shù)控技術(shù)，開發(fā)超硬金剛石砂輪微尖端的精密修整工藝[18]，可不依賴修整工具形狀，如圖1所示。進(jìn)而開發(fā)物理機(jī)械復(fù)合去除的脈沖放電修整技術(shù)，如圖1(b)所示，與機(jī)械修整技術(shù)相比提高效率約59倍[19]。

圖2為砂輪微尖端數(shù)控修整的誤差補(bǔ)償前后輪廓圖。金剛石砂輪尖端角度α可修整到60°±2.0°和尖端半徑r為58.84 μm。開發(fā)誤差補(bǔ)償?shù)臄?shù)控修整工藝，其角度偏差達(dá)到±0.6°，尖端半徑r達(dá)到25.0 μm。進(jìn)而，調(diào)整工藝，α偏差可為±0.5°，r約為5 μm。

圖2 微尖端修整的誤差補(bǔ)償Fig.2 Error compensation of wheel micro-tip truing

圖3 砂輪微尖端的金剛石磨粒形貌Fig.3 Diamond grain shapes on the trued wheel micro-tips

圖3為砂輪微尖端上磨粒形貌?？梢园l(fā)現(xiàn)：修整后的砂輪微尖端上分布的金剛石磨粒切削刃也能被修整成同一角度。因此，研發(fā)的砂輪微尖端精密修整工藝也可以使隨機(jī)分布的微磨粒出刃高度和方向與砂輪微尖端的切削方向保持一致。

圖4為石英表面的微V槽陣列形貌圖。在vf=500 mm/min,N=2 400 round/m和a=20 μm的磨削條件下，采用砂輪微尖端，控制多個磨粒塑性域切削深度[19]，在石英玻璃表面進(jìn)行機(jī)械復(fù)制的微磨削。可以發(fā)現(xiàn)，微V槽流道邊沿?zé)o破碎，表面光滑，角度α偏差與砂輪微尖端偏差基本一致，小于1°，尖端半徑r約為15 μm。因此，相比激光等物理加工，金剛石微磨削技術(shù)可以加工出高精度V尖角的微V槽流道。通過數(shù)控技術(shù)可以加工出有梯度的微V槽流道。

圖4 石英玻璃表面微V槽磨削加工Fig.4 Micro-V-groove grinding on quartz glass surface

3 微流控芯片的設(shè)計

圖5為微V槽流道的液體自驅(qū)動幾何模型。其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征化參數(shù)為：微V槽的角度α、尖端半徑r和梯度η。當(dāng)微流體進(jìn)入微流道后，底部尖角及納米裂紋流道對微流體產(chǎn)生吸附力，形成微流體前端凹面[20]。它可以破壞最小表面的表面能狀態(tài)，形成前端表面張力，導(dǎo)致微流體自動填充凹面，減少前端表面積和降低表面能，誘導(dǎo)和驅(qū)動微液體流動。

圖5 自驅(qū)動流道的幾何拓?fù)淠Ｐ虵ig.5 Geometric topography of self-driven channel

圖6為微流控芯片設(shè)計圖。芯片尺寸為60×60×3 mm，有進(jìn)樣口、樣品緩沖室、反應(yīng)池(φ5 mm)和氣壓控制池(φ4 mm)等，通過微流道相互連接。在設(shè)計中，采用直線梯度的微V槽流道的流道(圖6(b))，防止微液體回流，取代矩形的環(huán)形流道(圖6(a))。

圖6 病原體檢測的微流控芯片設(shè)計Fig.6 Design of microfluidic chip for pathogen detection

結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplitication,LAMP)技術(shù)，開發(fā)病原體檢測試劑盒和可見光波段的熒光反應(yīng)染料，檢測病原體核酸。在芯片上實現(xiàn)檢測液預(yù)埋、檢測樣本進(jìn)樣和混合、等溫核酸擴(kuò)增和光學(xué)測試。

4 微V槽流道的自驅(qū)動拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特性

圖7為微V槽流道表面粗糙度不同的流速測量。將微流控芯片固定在檢測平臺上，采用視頻逐幀處理記錄微流體流動過程，每條微流道重復(fù)進(jìn)行3次流速測量。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微V槽流道角度α為60°時，表面粗糙度Ra為104.0 nm的流速vm為5.9 mm/s，而Ra為31.2 nm的流速vm為18.7 mm/s，提高流速3倍以上。這表明：納米粗糙表面有利于提高微液體流速。

采用同樣方法可以測得，當(dāng)微V槽流道角度α為120°時，微液體流速vm為16.5 mm/s。其角度α為60°時，流速增加到18.7 mm/s，流速增幅約為13%。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微流道梯度η為0.42°時，微液體流速vm為3.8 mm/s，比無梯度的2.5 mm/s流速提高約52%。此外，微流道條數(shù)越少，流速越高。這表明，更小微V槽角度，更大梯度和更少流道數(shù)有利于微流體自驅(qū)動流動。

圖7 不同表面粗糙度Ra的微液體流速測量Fig.7 Flowing velocity measurement with different surface roughness Ra

圖8為兩種不同液體的混合面積圖及變化曲線。該實驗結(jié)果顯示，在面積S為12.6 mm2和20.6 mm2的流池里，微液體的混合速率分別為18.2 mm2/s和36.2 mm2/s。這表明，微液體從微V槽中快速流出，可與流池里的液體快速混合。而且，自驅(qū)動與負(fù)壓相結(jié)合可以將流速提高約1倍，微液體從進(jìn)樣室流到反應(yīng)室只需0.14 s。

圖8 流池的微流體混合面積S隨時間變化圖Fig.8 Microfluid mixing area S versus time in reaction cells

圖9為有無納米裂紋流道的微液體流速vm。檢測數(shù)據(jù)是來源于前期研究實驗[20]。結(jié)果顯示：有納米流道的位置可以將流速vm提高30%～71%，有利于微液體在驅(qū)動。這說明，微V槽尖端分布納米流道可驅(qū)動微液體流動。為了驗證其納米裂紋流道的存在，進(jìn)行金剛石切削刃(四面頂錐)的石英玻璃表面切入壓印實驗，壓力1.961 N，切削刃端的裂紋擴(kuò)展如圖10所示。

圖9 有無納米流道的微液體流速vmFig.9 Flowing velocity vm with or without nano-channels

圖10 金剛石切痕端的納米流道形貌Fig.10 Morphology of nano-channels at the diamond cut end

從圖10中可以看到，其前端因裂紋可以產(chǎn)生納米流道，其寬度小于160 nm，深度約50～100 nm，深寬比為0.3～0.7。這可以說明：在微V槽流道的磨削中，磨粒切削刃尖端的機(jī)械壓入會在微V槽尖角處滋生裂紋，進(jìn)而產(chǎn)生納米流道，誘導(dǎo)微液體自驅(qū)動運(yùn)動。

5 病原體檢測實驗

布魯氏菌病(Brucella. spp)，是一種由布魯氏菌引起的，導(dǎo)致繁殖能力降低的人獸共患病。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)是鏈置換型DNA聚合酶的分子生物學(xué)方法，用于檢測布魯氏菌。先開發(fā)病原體核酸檢測用的DNA提取試劑盒(T003S/L)和布魯氏菌核酸檢測試劑盒，對應(yīng)的檢測靶標(biāo)基因為布魯氏菌Omp25基因，然后開發(fā)檢測雙鏈DNA的熒光染料SYBR GREEN，染料底色為橘黃色，發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)為綠色，則檢測樣品中含有布魯氏菌。

實驗步驟：

(1)提取病原體核酸；

(2)將芯片超聲波酒精清潔5 min，再蒸干酒精；

(3)配置樣品待檢液：12.5 μL緩沖液，0.5 μL無菌水，2 μL待檢樣品，共15 μL；

(4)配置預(yù)加載檢測試劑：8 μL無菌水，1 μL Bst酶，1 μL引物，共10 μL；

(5)將10 μL預(yù)加載檢測試劑加入反應(yīng)池，然后PET薄膜封裝；

(6)在真空桶中抽走芯片空氣，形成負(fù)壓；

(7)在樣品緩沖室中加入樣品待測液，然后刺破貼膜啟動負(fù)壓引流，將樣品引入；

(8)LAMP擴(kuò)增檢測：刺破氣壓控制室，放置于恒溫金屬浴儀器中在63 ℃下恒溫保持45 min；

(9)取出芯片，在紫外燈下觀察。

6 檢測結(jié)果與分析

在實驗中，將空腸彎曲桿菌、布魯氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌3種病原體的靶標(biāo)基因?qū)?yīng)的檢測試劑和陰性對照檢測試劑分別加入到芯片的反應(yīng)池，如圖11所示(彩圖見期刊電子版)。結(jié)果顯示，空腸彎曲桿菌檢測試劑、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測試劑以及陰性對照試劑與布魯氏菌的Omp25基因不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，呈無色的陰性。但是，布魯氏菌檢測試劑與布魯氏菌的Omp25基因發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，呈綠色的陽性。而且，特異性良好，未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散和試劑污染。

圖12為LAMP病原體檢測靈敏度的實驗結(jié)果(彩圖見期刊電子版)。在實驗中，將含有布魯氏菌基因組DNA的待測樣本引入進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。將待測樣本以10倍梯度進(jìn)行濃度稀釋，重復(fù)實驗，發(fā)現(xiàn)不同濃度的檢測樣本均出現(xiàn)良好的結(jié)果。此外，布魯氏菌基因組DNA樣本與布魯氏菌檢測試劑發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，上孔、左孔和下孔均顯綠色，而右孔顯橘黃色，這說明樣本與對照檢測試劑不反應(yīng)。由此可知，布魯氏菌DNA的最低檢測濃度可以達(dá)到100 ag/μL及以下。

圖11 特異性檢測實驗Fig.11 Specific detection experiment

圖12 梯度濃度布魯氏菌基因組DNA檢測Fig.12 Gradient concentration detection of Brucella genomic DNA

7 結(jié) 論

開發(fā)金剛石砂輪微尖端的精密修整工藝，將砂輪及其尖端上磨粒修整成同一角度60°，其角度端偏差達(dá)到±0.5°。在塑性域削加工的機(jī)械復(fù)制下，可將石英玻璃芯片表面磨削出高精度的微V槽流道，其表面粗糙度達(dá)到30 nm、尖端半徑達(dá)到15 μm。

石英玻璃微V槽磨削需要工藝時間，但石英玻璃芯片可重復(fù)使用。該技術(shù)可加工玻璃和PMMA芯片模壓成型的模芯，用于微流控芯片的快速生產(chǎn)。

在微流控芯片中，微V槽角度和表面粗糙度越小以及梯度越大，流速越快，且深寬比為0.3～0.7的納米流道也可誘導(dǎo)微液體流動。此外，通過微V槽流道的液體也可以經(jīng)過微流池90°邊角的微V槽快速流入，與其他液體混合。微液體從加載室流到反應(yīng)室只需0.14 s。

根據(jù)微液體自驅(qū)動的微流道拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)尺度效應(yīng)，設(shè)計自驅(qū)動的微流控芯片。在檢測實驗中，布魯氏菌檢測試劑與布魯氏菌的Omp25基因發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果呈綠色的陽性，而且，特異性良好，未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散和檢測試劑污染等干擾問題。布魯氏菌的病原體核酸檢測靈敏度可以小于100 ag/μL。