趙四成 ，陳 櫞 ，李海東 ，陳 鐵 ，吳金東 ，李懷亮 ，侯煒曉 ，張一心 ，江曉暉

（1 南通大學(xué)附屬婦幼保健院普外科，江蘇 226018；2 南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院普外科；3 南通大學(xué)研究生院臨床醫(yī)學(xué)系）

叉頭框 Q1（Forkhead boxQ1, FOXQ1）是 FOX 家族成員之一，定位于人類染色體6p25.3[1]。研究表明，F(xiàn)OXQ1 在肝癌[2]、食管癌[3]、乳腺癌[4]等腫瘤組織中過表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。Liang 等[5]發(fā)現(xiàn)FOXQ1 在胃癌中高表達(dá)，是患者預(yù)后不良的獨立指標(biāo)。Peng 等[6]抑制SW480 結(jié)腸癌細(xì)胞株FOXQ1 的表達(dá)，并不能增加細(xì)胞凋亡，但與化療藥物5-FU 和奧沙利鉑共同處理后，發(fā)現(xiàn)抑制FOXQ1 表達(dá)可提高化療藥物的殺傷作用，降低SW480 細(xì)胞對化療的耐藥性。Ki-67 公認(rèn)為評估術(shù)后化療療效的重要指標(biāo)[7]。本研究收集南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2007 年1月—2011 年6 月胃癌組織石蠟標(biāo)本167 例，分析進(jìn)展期胃癌組織中FOXQ1 與增殖指數(shù)Ki67 的相關(guān)性，F(xiàn)OXQ1 在術(shù)后輔助性化療中的臨床意義以及對患者RFS 預(yù)后的影響，評價FOXQ1 作為評估預(yù)后因子的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 進(jìn)展期胃癌167 例，其中女性53例，男性 114 例，年齡 35～83 歲，平均 61.59±11.11歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤浸潤深度超過粘膜下層的進(jìn)展期胃癌（T2-4）；（2）按中國臨床腫瘤學(xué)會（CSCO）原發(fā)性胃癌診療指南（2017.V1）TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)為Ib-IIIa 期[8]；（3）術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療，均行胃癌D2 根治性手術(shù)，術(shù)后完成SOX 方案輔助化療6個周期；（4）未合并其他惡性腫瘤及嚴(yán)重內(nèi)科基礎(chǔ)疾病。胃癌術(shù)后完成SOX 方案輔助化療6 個周期后，隨訪5 年，中位隨訪時間39.46±28.61 月，記錄患者無復(fù)發(fā)生存期（RFS），RFS 指的是根治性手術(shù)到首次復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的時間（含病理及影像學(xué)提示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）。

1.2 檢測FOXQ1 及Ki67 表達(dá) 采用免疫組化SP法檢測FOXQ1 及Ki67 表達(dá)。兔抗人FOXQ1 單克隆抗體（美國 Abcam 公司）工作液按 1∶300 稀釋，兔抗人Ki67 單克隆抗體（美國 Abcam 公司）工作液按1∶250 稀釋，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（Dako Cytomation，USA）工作液按 1∶100 稀釋。具體操作方法見參考文獻(xiàn)[2，9]。結(jié)果判定：隨機(jī)選擇5 個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)500 個細(xì)胞，計算FOXQ1 陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率，評判標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]。Ki67 判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7，9]。免疫組化切片在光鏡下進(jìn)行圖像分析，采用IPWIN60 圖像熒光分析軟件，每張切片觀察5 個高倍視野，測量細(xì)胞質(zhì)中FOXQ1和Ki67 表達(dá)的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件處理分析數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗分析FOXQ1 和Ki67 蛋白表達(dá)與臨床各參數(shù)的關(guān)系；采用Pearson 法對FOXQ1 與Ki67 相關(guān)性進(jìn)行分析；采用Kaplan-Meier 和Logrank 檢驗分析RFS。采用單變量Cox 比例風(fēng)險回歸分析患者的生存差異，單因素回歸分析中有意義因素進(jìn)一步納入多因素回歸分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FOXQ1 和 Ki67 免疫 組化 染 色 FOXQ1 和Ki67 定位于細(xì)胞核中，呈深褐色染色（圖1）。將復(fù)染后的石蠟切片進(jìn)行掃描，對切片平均光密度值進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FOXQ1 與Ki67 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈中度正相關(guān)（r=0.77，P＜0.001）。見圖2。

圖 1 FOXQ1 和 Ki67 免疫組化染色（200×）

圖2 胃癌組織中FOXQ1 和Ki67 表達(dá)相關(guān)性

2.2 FOXQ1 和 Ki67 表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系 FOXQ1 和Ki67 與組織學(xué)分級、浸潤深度T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、血管癌栓有關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、是否神經(jīng)侵犯無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

表1 胃癌組織中Ki67 及FOXQ1 蛋白的表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系 例（%）

2.3 術(shù)后RFS 影響因素分析 單因素COX 回歸分析發(fā)現(xiàn)RFS 與患者性別、年齡、神經(jīng)侵犯無關(guān)（P＞0.05），但是與腫瘤的組織學(xué)分級（HR=0.6，P=0.018）、浸潤深度 T 分期（HR=0.492，P=0.005）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=0.506，P=0.005）、TNM 分期（HR=0.515，P=0.006）、血管癌栓（HR=0.530，P=0.011）、Ki67 高表達(dá)（HR=0.296，P＜0.001）、FOXQ1 高表達(dá)（HR=0.365，P＜0.001）有關(guān)。將上述有意義因素納入多因素COX回歸分析，顯示患者RFS 與FOXQ1 高表達(dá)（HR=2.962，P＜0.001）、Ki67 高表達(dá)（HR=2.416，P＜0.001）有關(guān)。見表2。Kaplane-Meier 生存曲線分析顯示，F(xiàn)OXQ1 和Ki67 高表達(dá)患者術(shù)后RFS 生存率低于FOXQ1 和Ki67 表達(dá)陰性者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3。

表2 單因素和多因素回歸分析影響GC 患者RFS 預(yù)后的相關(guān)因子

圖3 Kaplane-Meier 生存曲線

3 討 論

我國屬于胃癌高發(fā)國家，發(fā)病率居世界第2 位，死亡率居世界第3 位，高于世界平均水平，每年新增胃癌病例及死亡病例占全世界40%，位居首位[10]。隨著我國胃鏡檢查的普及和診療手段的發(fā)展，促進(jìn)了胃癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療，患者總生存率有所提高，但胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)的比例依然較高[11]。因此，研究胃癌的耐藥基因，優(yōu)化治療方案，合理選擇化療藥物，顯得尤為重要。

FOXQ1 過表達(dá)與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)，可作為判斷胃癌預(yù)后不良的獨立指標(biāo)[5]。有研究檢測60 例胃癌組織中miR-1271 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-1271 表達(dá)與腫瘤大小、T 分期、N 分期、TNM 分期密切相關(guān)，而與FOXQ1 負(fù)相關(guān)。研究表明，miR-1271 下調(diào)胃癌細(xì)胞中FOXQ1 的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1 和同一家族的FOXC2 共同作用，影響胃癌患者的預(yù)后[13]。細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)TAM/FOXG1 通路是影響胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵信號通路[14]。還有學(xué)者認(rèn)為FOXQ1 作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白，通過Snail 信號通路發(fā)揮重要作用，F(xiàn)OXQ1 過表達(dá)影響胃癌的間質(zhì)表型，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-345 是FOXQ1 上游調(diào)控miRNA，通過抑制胃癌細(xì)胞的EMT 來抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。過表達(dá)FOXQ1 可逆轉(zhuǎn)miR-345 對胃癌轉(zhuǎn)移的抑制作用，而敲除FOXQ1 則可阻止miR-345 基因敲除對胃癌轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。Bcl-2 被認(rèn)為是miR-345 的新靶點，其過表達(dá)可以拮抗miR-345 在胰腺癌細(xì)胞中的促凋亡作用[17]，Bcl-2 可以拮抗多種細(xì)胞毒藥物引起的細(xì)胞凋亡。替吉奧可增加Bax 表達(dá)及Bax/Bcl-2 比值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。Bax 表達(dá)及Bax/Bcl-2 比值的高低影響奧沙利鉑治療胃癌患者的總生存率[19]。FOXQ1 過表達(dá)可抑制miR-345 表達(dá)，從而可能上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，下調(diào)Bax 表達(dá)及Bax/Bcl-2 比值，達(dá)到抑制凋亡的作用。

Ki67 常用于評估腫瘤大小、分級、腫瘤增殖活性以及化療后腫瘤細(xì)胞的壞死情況[7]。本研究以Ki-67 作為參考，評估FOXQ1 高表達(dá)對胃癌術(shù)后SOX化療方案的影響，為進(jìn)展期胃癌患者的術(shù)后治療方案提供參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃癌的組織中，F(xiàn)OXQ1 表達(dá)與Ki67 表達(dá)呈中度正相關(guān)；FOXQ1 和Ki67 表達(dá)與組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期及血管癌栓有關(guān)（P＜0.05）；多因素回歸分析顯示FOXQ1和 Ki67 高表達(dá)影響患者 RFS（P＜0.05）；Kaplane-Meier 生存曲線分析顯示，F(xiàn)OXQ1 和Ki67 高表達(dá)患者術(shù)后RFS 生存率低于FOXQ1 和Ki67 表達(dá)陰性者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，進(jìn)展期胃癌組織中FOXQ1 與Ki67表達(dá)呈正相關(guān)，F(xiàn)OXQ1 及Ki67 高表達(dá)影響SOX 化療方案的效果，與患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，高表達(dá)患者RFS 縮短，F(xiàn)OXQ1 聯(lián)合Ki67 檢測可能有助于預(yù)測胃癌患者的預(yù)后和制定相應(yīng)的治療策略。