郭秉楠 （ 徐州醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生應(yīng)急研究所； 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心，江蘇004）

固有淋巴細(xì)胞（innate lymphoid cell，ILC）作為一種組織駐留細(xì)胞（tissue-resident cell），主要分布在腸、肺和皮膚等組織器官中，發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)，組織修復(fù)，抗擊各種病原體、過敏原及腫瘤等作用，在感染性疾病、自身免疫性疾病、炎癥及腫瘤等疾病中具有重要意義[1-2]。根據(jù)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子及分泌細(xì)胞因子不同，ILCs 通常分為 ILC1，ILC2 和 ILC3[1]。其中ILC2 主要分泌 Th2 型細(xì)胞因子如 IL-4、IL-5、IL-9及IL-13 等以及高表達(dá)GATA3 轉(zhuǎn)錄因子[3]。不同于T 細(xì)胞，ILC2 無需特異性抗原激活，IL-33、IL-25、胸腺基質(zhì)淋巴生成素（TSLP）以及二十烷酸類物質(zhì)均可激活I(lǐng)LC2[4-6]。然而，不同組織器官中的ILC2 是否存在功能差異，以及對不同激活劑的反應(yīng)性目前尚不清楚。本研究通過比較腸道和肺中ILC2 的表達(dá)差異，旨在更好理解不同組織中ILC2 的功能和特性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6 小鼠，6～8 周，雌性，20～25 g（南京大學(xué)模式動物中心），飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物中心。各種細(xì)胞因子（R&D 公司），GSI（Calbiochem公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶（Gibco 公司），細(xì)胞增殖用 EdU（Thermo Fisher 公司），RNeasy 試劑盒（QIAGEN），Reverse Transcrip tase superscript II 試劑盒（Invitrogen），Sybr green real-time PCR 試劑盒（寶生物公司），EdU 檢測試劑盒（Thermo 公司）。培養(yǎng)用細(xì)胞因子 IL-2、IL-7 和 IL-25（Peprotec 公司），anti-B220（RA3-6B2）、anti-NK1.1（PK136）、anti-CD11b（M1/70）、anti-CD3（2C11）、anti-CD5（53-7.3）、anti-CD45.2（104）、anti-Thy1.2（53-2.1）、anti-CD25（PC61.5）、anti-T1/ST2（DJ8）和 anti-TCRβ（H57）（BioLegend 公司 或 Thermo 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞：取1×108個腸或肺細(xì)胞放置于流式管中，用500 μL 流式緩沖液（含0.5%FBS 的 PBS）洗 2 遍，以 300 μL 流式緩沖液重懸細(xì)胞，加入相應(yīng)抗體，輕輕混勻后4 ℃避光孵育30 min，500 μL 流式緩沖液洗 2 遍，上 FACSAria III 流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞分選。以下標(biāo)記細(xì)胞被認(rèn)為是ILC2 細(xì)胞：B220（-）、NK1.1（-）、CD11b（-）、CD45.2（+）、CD3（+）和 T1/ST2（+）；在有些實驗中 B220（-）、NK1.1（-）、CD11b（-）、CD45.2（+）、Thy1.2（+）或TCRβ（+）和 CD25（+）。

1.2.2 real-time PCR 檢測細(xì)胞因子：取分選后的ILC2 細(xì)胞用RNeasy 試劑盒提取RNA，采用Reverse transcriptase superscript II 試劑盒合成cDNA，利用引物及Sybr green real-time PCR 試劑盒在LC480 real-time PCR 儀上進行細(xì)胞因子檢測，以GAPDH為內(nèi)參。引物由上海金斯特公司合成，序列見表1。

表1 實驗所用引物序列

1.2.3 EdU 檢測細(xì)胞增殖：取分選后的ILC2 細(xì)胞1×104個放入 96 孔板，以 10 μmol/L EdU 孵育 2 h，加入10 ng/mL 不同細(xì)胞因子孵育7 d。去除培養(yǎng)基，用PBS 洗 2 遍，每孔加入 100 μL Click-iTR fixative，避光室溫放置15 min。去除溶液，PBS 洗3 次，每孔加入100 μL Click-iTR固定液，室溫放置15 min。每孔加入 0.5 mL Click-iTRPlus reaction cocktail，避光室溫放置30 min。Click-iTR固定液洗3 次后，500 μL Click-iTR固定液重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 GSI 抑制 Notch 信號對 IL-25 介導(dǎo) ILC2 增殖：C57BL/6 小鼠腹腔注射 IL-25（500 ng/只），連續(xù)4 天。配置1 mg/mL GSI 溶液于DMSO，每日注射IL-25 前 4 h 以 0.2 mg/只 GSI 溶液注射于 C57BL/6小鼠腹腔。4 d 后處死小鼠，取肺和腸ILC2 細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸和肺ILC2 細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 腸ILC2 細(xì)胞與肺 ILC2 細(xì)胞相比，IL-13 mRNA（3.47±0.73 vs 0.97±0.17） 及 IFN-γ mRNA（2.45±0.74 vs 1.08±0.25）表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IL-17 mRNA（1.46±0.90）在腸 ILC2 中高表達(dá)而在肺 ILC2 中不表達(dá)，但 IL-5 mRNA（0.38±0.12 vs 0.98±0.17）表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；腸 ILC2 轉(zhuǎn)錄因子 GATA3 mRNA 表達(dá)量升高（1.19±0.23），但與肺 ILC2（0.98±0.17）的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。以上結(jié)果提示腸和肺中ILC2 表達(dá)的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子差異巨大。

圖1 腸和肺中ILC2 細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

2.2 IL-25 對腸和肺ILC2 細(xì)胞體外增殖及活化的影響 EdU 檢測結(jié)果顯示，腸ILC2 在IL-25 刺激下，與肺相比，體外增殖提高約8 倍（43.50±14.89 vs 5.47±2.17），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2A）；IL-25 刺激后腸 ILC2 IL-5 mRNA（3.20±0.91）和 IL-13 mRNA（15.88±8.28）表達(dá)水平分別顯著高于肺ILC2（1.00± 0.26）、（0.82± 0.10），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 2B）。以上結(jié)果提示 IL-25 可以促進腸ILC2 的活化和增殖。

圖2 IL-2 促進ILC2 細(xì)胞增殖和活化

2.3 腸和肺ILC2 IL-25 受體表達(dá)及IL-25 對ILC2體內(nèi)增殖的影響 腸ILC2 與肺ILC2 細(xì)胞相比，IL17RB（IL-25 受體）mRNA（85.25±22.16 vs 1.43±0.17）表達(dá)水平顯著升高，而傳統(tǒng)ILC2 活化IL1RL1（IL-33 受體）mRNA（0.02±0.01 vs1.07±0.18）表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A）。分別用 IL-33（500 ng/d）、IL-25（500 ng/d）腹腔注射C57BL/6 小鼠3 天后，EdU 檢測結(jié)果顯示，IL-25 刺激后腸內(nèi)ILC2 細(xì)胞增殖顯著增加，而IL-33刺激后肺中ILC2 細(xì)胞增殖顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖 3B）。以上結(jié)果提示腸 ILC2 高表達(dá)IL-25 受體IL17RB，而肺ILC2 高表達(dá)IL-33受體IL1RL1，體內(nèi)實驗進一步證實IL-25 是腸ILC2增殖和活化的刺激劑。

圖3 腸和肺中ILC2 細(xì)胞受體表達(dá)及其對增殖的影響

2.4 Notch 信號對IL-25 介導(dǎo)的腸ILC2 體外增殖的影響 real-time PCR 分析腸和肺 ILC2 細(xì)胞Notch 信號公認(rèn)的靶標(biāo)基因Dtx1 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示與肺相比，腸ILC2 細(xì)胞Dtx1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4A）。取GSI 和IL-25 處理后小鼠，在體外培養(yǎng)腸ILC2 細(xì)胞中加入Dtx1 抑制劑GSI，腸ILC2 細(xì)胞體外增殖顯著降低（圖4B）。以上結(jié)果提示IL-25 介導(dǎo)的腸ILC2細(xì)胞的增殖依賴于Notch 信號通路。

圖4 Notch 信號對IL-25 活化ILC2 細(xì)胞的影響

3 討 論

ILCs 是一群類似于T 細(xì)胞但不同于T 細(xì)胞表面表達(dá)多種抗原受體的淋巴細(xì)胞，ILC2 具有分泌IL-4、IL-5 和 IL-13 等Ⅱ型細(xì)胞因子能力的 ILCs[7]。目前，越來越多的證據(jù)表明ILCs 具有異質(zhì)性，如體內(nèi)注射IL25 或IL-33 可以使得ILC2 具有截然不同的功能，注射IL-25 產(chǎn)生的ILC2 分泌IL-17 及Ⅱ型細(xì)胞因子，這種ILC2 被稱為 iILC2（inflammatory ILC2s）[8]，而注射 IL-33 產(chǎn)生的 ILC2 僅具有分泌Ⅱ型細(xì)胞因子的能力，這種ILC2 被稱為nILC2（natural ILC2s）[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，腸與肺ILC2 的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)譜不同，由于表達(dá)的受體不同，導(dǎo)致腸和肺ILC2 活化的細(xì)胞因子亦不相同，Notch 信號可影響腸 ILC2 的活化[10]。

Ⅱ型細(xì)胞因子主要發(fā)揮促進炎癥反應(yīng)的作用。ILC2 因能分泌大量IL-5 和IL-13，在變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮作用；IL-33 滴入野生型小鼠鼻腔后，小鼠肺能快速產(chǎn)生大量IL-5 和IL-13[11]。雖然IL-4 和IL-9 亦為ILC2 分泌的主要細(xì)胞因子，但為了后續(xù)更好研究變態(tài)反應(yīng)性疾病以及比較IL-25與IL-33 對不組織ILC2 的作用，本研究選擇檢測IL-5 和IL-13 兩種細(xì)胞因子。本研究發(fā)現(xiàn)，腸ILC2的IL-13 等Ⅱ型細(xì)胞因子的基礎(chǔ)表達(dá)顯著高于肺ILC2，而IL-5 基礎(chǔ)表達(dá)則顯著低于肺ILC2（圖1）；IL-25 刺激后，肺 ILC2 的 IL-13、IL-5 的表達(dá)與基礎(chǔ)表達(dá)相比均無顯著變化，但腸ILC2 的IL-13、IL-5的表達(dá)分別升高約5 倍和3 倍（圖1、2），顯示IL-25可以活化腸ILC2，同時可解釋腸ILC2 中IL-5 基礎(chǔ)表達(dá)顯著低于肺ILC2，活化后顯著高于肺ILC2 的原因。同時，腸ILC2 的細(xì)胞因子IFN-γ 和IL-17 則顯著升高，Ⅱ型轉(zhuǎn)錄因子GATA3 雖然上升，但與肺相比無顯著性差異（圖1）。大量文獻證實[12-13]，肺中ILC2 的增殖與活化主要依賴于IL-33 及其受體IL1RL1，而IL-25 能顯著提高腸ILC2 而非肺ILC2細(xì)胞的增殖與活化能力（圖2），提示不同組織ILC2的異質(zhì)性。本研究進一步發(fā)現(xiàn)腸ILC2 高表達(dá)IL-25受體 IL17RB，而肺 ILC2 高表達(dá) IL-33 受體IL1RL1，從而可解釋IL-25 活化腸ILC2 細(xì)胞能力的原因。最后，本研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號作為重要的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動因子在誘導(dǎo)ILC2 細(xì)胞可塑性方面發(fā)揮重要作用。首先我們發(fā)現(xiàn)，Notch 信號通路的靶蛋白基因Dtx1 表達(dá)在腸ILC2 中顯著增高，Dtx1 抑制劑GSI處理可抑制IL-25 對ILC2 增殖的促進作用。

綜上所述，腸ILC2 細(xì)胞通過其IL-25 受體IL17RB 與IL-25 結(jié)合，表現(xiàn)出與肺ILC2 不同的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子表達(dá)譜，同時腸ILC2 這種依賴于IL-25 的作用受到Notch 信號通路調(diào)控。腸道中這種既具有ILC2 又具有ILC3 雙重功能細(xì)胞是哮喘或流感等許多自身免疫性疾病和炎癥性疾病的重要驅(qū)動因素，為治療上述疾病提供新靶點和理論依據(jù)。