左靈妮 劉 康 馬曉勤

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，近年來的發(fā)病率和死亡率都有顯著上升趨[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生受到多因素、多階段、多基因變異等共同影響，是從正常黏膜-瘤-癌的演變過程，在此過程中伴隨所有癌基因、抑癌基因和生長因子基因等多種基因的表達(dá)改變[2-3]。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)在人體中的感染率比較高，也為一種環(huán)狀DNA病毒[4]。根據(jù)HPV亞型與腫瘤發(fā)生的關(guān)系可將HPV分為低中危型和高危型，高危型HPV包括HPV16、18等[5-6]。HPV16、18與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，95%以上的宮頸癌組織中都可檢測(cè)到HPV DNA[7]。近年來HPV與消化道腫瘤的關(guān)系也逐步得到了重視，在結(jié)直腸癌中也有一定感染率，但是具體的作用關(guān)系還不明確[8]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生的能力，可以增強(qiáng)毛細(xì)血管的通透，在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況[9]。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-9的高表達(dá)可促使腫瘤組織微血管、微淋巴管的生成，從而間接促使惡性腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的發(fā)生[10]。本文具體探討與分析了HPV16、18感染與結(jié)直腸癌的相關(guān)性，以明確HPV16、18的作用效果與機(jī)制。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究得到了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，2017年6月至2019年6月選擇本院診治的結(jié)直腸癌患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷為結(jié)直腸癌；臨床與病理資料完整；標(biāo)本采集前均未接受放療、化療或激素治療；年齡20～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：免疫缺陷疾病患者；臨床與病理資料缺項(xiàng)者；妊娠或哺乳期婦女及女性育齡患者。80例患者中男性38例，女性42例；年齡最小26歲，最大78歲，平均年齡(47.49±3.39)歲；臨床分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期17例，Ⅲ期24例；組織學(xué)分化：高分化42例，中分化28例，低分化10例；病理類型：腺癌70例，鱗癌10例。

1.2 HPV16/18檢測(cè)

取所有患者的病灶組織標(biāo)本(病灶組)與癌旁組織標(biāo)本(癌旁組)，經(jīng)過無菌水漂洗處理，使用無菌眼科剪剪成約1 mm3大小，加適量0.25%胰蛋白酶置37 ℃水浴消化，消化后的懸液經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾后移入試管，5 000 rpm/min離心5 min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用Hanks液洗2～3次，獲得單細(xì)胞懸液。采用磁珠法(碩世生物科技股份公司)提取組織總RNA，采用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)HPV16/18含量，以HPV1基因組L1區(qū)為靶區(qū)域，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 免疫組化檢測(cè)

兔抗人VEGF多抗購自英國Abcam公司(稀釋濃度為1∶500)；鼠抗人MMP-9單抗(稀釋濃度1∶200)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照，已知的結(jié)直腸癌組織作為陽性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書操作。VEGF、MMP-9細(xì)胞核棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無染色0分；陽性細(xì)胞百分比≤5%為0，>5%～25%為1，>25%～50%為2，>50%～75%為3，>75%為4；二者乘積≥4分為表達(dá)陽性。

1.4 臨床調(diào)查

調(diào)查所有患者的臨床資料與病理資料，對(duì)調(diào)查記錄項(xiàng)目統(tǒng)一進(jìn)行編碼與保管。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用軟件SPSS 20.00進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，對(duì)比為t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以百分比表示，對(duì)比為χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPV16、18感染率對(duì)比

病灶組的HPV16、18感染率分別為33.8%(27/80)和37.5%(30/80)，顯著高于癌旁組的6.3%(5/80)和7.7%(6/80)(χ2=18.906、20.645，P均<0.05)。

2.2 VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率對(duì)比

病灶組的VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率為75.0%(60/80)和71.3%(57/80)，顯著高于癌旁組的16.3%(13/80)和24.4%(19/80)(χ2=55.651、36.19，P均<0.05)。

2.3 HPV16、18感染率與VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率的相關(guān)性

在病灶組織標(biāo)本中，VEGF、MMP-9不同表達(dá)特征患者的HPV16、18感染率對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 VEGF、MMP-9不同表達(dá)特征患者的HPV16/18感染率對(duì)比(例，%)

Pearson相關(guān)分析顯示病灶組織的VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率與HPV16、18感染率都有顯著相關(guān)性(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)直腸癌病灶組織HPV16/18感染率與VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率的相關(guān)性(n=80)

3 討論

隨著世界人口老齡化，飲食習(xí)慣及生活方式的改變，結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率逐年增加。該病的病因至今尚未完全明了，不過其發(fā)病與多鹽飲食、遺傳、環(huán)境惡化、種族等因素有關(guān)[11]?，F(xiàn)代研究顯示結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)從正常到炎性進(jìn)而發(fā)展成腫瘤，同時(shí)伴有多基因改變逐漸積累的多步驟過程[12]。HPV是一類能特異感染人的皮膚和黏膜的環(huán)狀DNA病毒，分子長度大約為8 Kb，包括2個(gè)蛋白編碼區(qū)與1個(gè)無編碼的上游調(diào)節(jié)區(qū)，由6個(gè)開放讀碼結(jié)構(gòu)組成[13-14]。HPV具有宿主和組織特異性，是引起人上皮腫瘤的病毒，只能感染人的黏膜及上皮細(xì)胞。目前高危HPV中至少有多種型別與人類疾病關(guān)系密切，其中就包括HPV16、18[15-16]。本研究顯示結(jié)直腸癌患者伴隨有HPV16、18的高感染。當(dāng)前也有研究顯示消化道腫瘤與HPV之間存在著一定的聯(lián)系，在癌標(biāo)本中存在著病毒感染的超微征象與核內(nèi)HPV病毒顆粒[17-18]。VEGF的高表達(dá)與血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化等有顯著相關(guān)性，在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。MMP-9又稱為明膠酶B，MMP-9高表達(dá)情況下可使得膠原和明膠等發(fā)生降解作用，促使腫瘤微淋巴管的新生，也可促使腫瘤細(xì)胞突破基膜導(dǎo)致浸潤性轉(zhuǎn)移發(fā)生[19]。MMP-9在結(jié)直腸癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移能力與MMP-9的過表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)。腫瘤特異性的miRNAs表達(dá)譜對(duì)腫瘤的鑒別診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)具有重大的意義[20]。本研究顯示病灶組的VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率為75.0%和71.3%，顯著高于癌旁組的16.3%和24.4%，表明結(jié)直腸癌患者伴隨有VEGF、MMP-9的高表達(dá)。

癌基因和抑癌基因功能的異常變化在結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。本研究顯示在病灶組織標(biāo)本中，VEGF、MMP-9不同表達(dá)特征患者的HPV16、18感染率對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Pearson相關(guān)分析顯示病灶組織的VEGF、MMP-9表達(dá)陽性率與HPV16、18感染率都有顯著相關(guān)性。從機(jī)制上分析，HPV16、18感染可促使p53蛋白降解，最終引起p53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期G1期阻滯減弱，也破壞了機(jī)體正常的激素分泌功能，增加了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)VEGF、MMP-9的表達(dá)[22]。本研究也有一定的不足，病例數(shù)較少，且沒有納入健康人群，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，結(jié)直腸癌患者的HPV16、18感染比較常見，也多伴隨有VEGF、MMP-9的高表達(dá)，兩者存在顯著相關(guān)性，共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。