姚書鵬 李 軍 張友滿

胃癌是當(dāng)前常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病周期比較長，多由胃息肉發(fā)展而來[1]。現(xiàn)代研究表明胃息肉向胃癌的發(fā)展是一個由良性到惡性逐步演變的過程，不過由于各種因素的影響，胃息肉早期診斷率落后于發(fā)達(dá)國家，患者確診時大多數(shù)已進(jìn)展到胃癌，因此預(yù)后較差[2-3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)、現(xiàn)代免疫組織化學(xué)的不斷發(fā)展，通過檢測腫瘤細(xì)胞特異抗原等使早期檢出胃部疾病已成為了可能[4-5]。鼠類肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)是RAS家屬的1個基因，位于12號染色體，與腫瘤的血管生成、增殖、遷移均有關(guān)系[6-7]。KRAS基因容易發(fā)生突變，也是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中重要的“開關(guān)”，可產(chǎn)生具有致癌活性的KRAS蛋白，使細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，引起細(xì)胞癌變[8-9]。本文具體探討了胃癌的臨床病理特征與KRAS基因突變的相關(guān)性，希望為早期檢出胃癌提供參考，也希望明確KRAS基因的作用效果與機(jī)制。現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年3月至2018年4月選擇在本院進(jìn)行診治的120例胃癌患者(胃癌組)與120例胃良性病變(良性組)患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床病歷資料齊全，留存有病理組織樣本(均經(jīng)患者知情同意)；都符合胃癌或胃良性病變的診斷標(biāo)準(zhǔn)；原發(fā)于胃部疾病，非其他部位轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的胃部疾病病例；病理組織樣本取樣前都未經(jīng)過任何治療；研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：組織病理學(xué)不明確的病例；未行手術(shù)或活檢病例；妊娠孕婦與哺乳期婦女；精神疾病患者；臨床資料缺乏者。2組患者的性別、年齡、體重指數(shù)等對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組一般資料對比

在胃癌組中，臨床分期：早中期48例，晚期72例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例；分化程度：高分化60例，中分化40例，低分化20例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例；浸潤深度：<肌層40例，≥肌層80例。

1.2 標(biāo)本提取

2組的病理組織取出后經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃，病理組織基因組總DNA的提取采用TRIzol試劑(北京天根生化科技有限公司)一步提取法，提取的總DNA置于-80 ℃凍存，具體步驟參照說明書。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，選擇紫外分光光度儀(美國Amersham公司)測定DNA濃度和純度。

采用美國Invitrogen公司生產(chǎn)的PCR儀行PCR分析，對KRAS基因第2號外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，上游段引物為5'-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3'，下游段引物為：5'-AGGCCTGCTGAAAATGACTG-3'。PCR反應(yīng)體系為25 μl，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，55 ℃退火45 s，72 ℃下延伸45 s，40個循環(huán)，然后在72 ℃下延伸10 min。將PCR的產(chǎn)物直接進(jìn)行純化處理，應(yīng)用美國ABI3730XL測序儀進(jìn)行DNA測序。

1.3 調(diào)查內(nèi)容

調(diào)查2組患者的性別、年齡等資料，同時重點(diǎn)調(diào)查胃癌患者的臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況。隨訪1年，記錄胃癌患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計方法

選擇SPSS 20.00軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)或方差分析(采用百分比表示)，計量數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)(采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示)，相關(guān)性分析采用Cox多因素生存回歸分析，所有P值均為雙側(cè)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS基因突變率對比

胃癌組的KRAS基因突變率為75.0%(90/120)，顯著高于良性組的15.0%(18/120),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=87.273，P=0.000)。

2.2 胃癌組KRAS基因突變率與臨床病理特征的相關(guān)性

在120例胃癌患者中，不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度患者的KRAS基因突變率對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 胃癌患者KRAS基因突變率與臨床病理特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 隨訪預(yù)后

胃癌組患者隨訪至今，平均隨訪時間為(15.22±2.48)月，死亡12例，死亡率為10.0%。單因素和多因素Cox回歸分析顯示KRAS基因突變率、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度都為影響胃癌患者預(yù)后的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響胃癌患者預(yù)后的Cox回歸分析(n=120)

3 討論

胃癌為臨床上比較常見的惡性腫瘤，也是癌癥導(dǎo)致死亡的重要原因。當(dāng)前我國胃癌患者占全球胃癌發(fā)病總?cè)藬?shù)的40%左右，但是胃癌早期診斷率卻不到10%，并且由于缺乏有效治療手段，晚期胃癌的5年生存率長期低于10%[10]。有研究表明胃癌細(xì)胞增殖和凋亡是一個多因素、多步驟、多階段綜合作用的發(fā)展過程，改進(jìn)早期檢測手段、發(fā)展新型分子靶向治療策略具有重要價值[11-12]。目前對于胃癌發(fā)生的研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但是關(guān)于胃癌發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍然不是特別清楚。

KRAS是RAS基因家族成員之一，長約35 kb，與腫瘤的增殖、遷移、血管生成均有關(guān)系[13]。KRAS蛋白在信號肽轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，在關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生氨基酸突變從而產(chǎn)生具有致癌活性的KRAS蛋白，使細(xì)胞增殖失控，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，引起細(xì)胞癌變[14-15]。KRAS基因第2號外顯子的基因組PCR方法是目前檢測KRAS基因突變最靈敏、最可靠的方法。本研究顯示胃癌組的KRAS基因突變率與表達(dá)陽性率顯著高于良性組，表明胃癌組織中KRAS基因突變率比較高。已有研究顯示胃癌患者早期癥狀不顯著，多由良性病變發(fā)展而來，患者只有在出現(xiàn)腹痛等嚴(yán)重情況時才會到院就診[16]。與其它腫瘤一樣，胃癌的發(fā)生歸因于基因-環(huán)境的相互作用，正是這些基因多態(tài)性或修飾性，導(dǎo)致個體對環(huán)境因素可產(chǎn)生一定的敏感性[17]。 KRAS基因含有4個編碼外顯子和1個5'端非編碼外顯子，KRAS基因突變是腫瘤惡性程度增加的表現(xiàn)[18]。本研究顯示在120例胃癌患者中，不同臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度患者的KRAS基因突變率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明KRAS基因突變與胃癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度有關(guān)。

胃癌已成為世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因之一，而早期診斷可以改善胃癌的治療和預(yù)后，不過傳統(tǒng)常見的血清標(biāo)志物欠缺診斷特異性[19]。本研究單因素和多因素Cox回歸分析顯示KRAS基因突變率、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度都為影響胃癌患者預(yù)后的危險因素。從機(jī)制上分析，KRAS基因與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切，是細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中重要的“開關(guān)”，KRAS基因突變是鋸齒狀病變研究中最受關(guān)注的分子遺傳學(xué)改變[20]。KRAS蛋白的突變使KRAS蛋白不能被水解，處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而導(dǎo)致疾病的惡化，促使患者死亡[21]。然而本研究也存在一定的缺陷，沒有在胃癌發(fā)生與發(fā)展過程中針對KRAS基因突變情況進(jìn)行動態(tài)的檢測，也沒有進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，這些將在下一步進(jìn)行深入分析。

總之，KRAS基因突變在胃癌組織中比較常見，與患者的臨床病理特征顯著相關(guān)，可以作為預(yù)測胃癌發(fā)生和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。