朱 清 李世東 朱旭利

喉癌(laryngeal cance)以鱗狀細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，臨床表現(xiàn)為聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽困難、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，早期發(fā)現(xiàn)、盡早診斷和治療對(duì)減輕喉癌的危險(xiǎn)十分重要，一方面可明顯提高患者術(shù)后的生存率，其次可最大程度保留喉的發(fā)音功能，減少術(shù)后并發(fā)癥[1]。程度死亡因子1屬于CD28的家族成員，其配體有PD-L1和PD-L2，其中前者與PD-1結(jié)合后能夠傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，抑制T細(xì)胞活化和增殖，并且促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，在機(jī)體免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。本研究旨在通過(guò)免疫組化法分析PD-1蛋白和PD-L1蛋白在喉癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況，并且分析其與患者病理特征之間的關(guān)系，以期探討喉癌發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

將我院自2018年6月至2019年6月間收治的經(jīng)手術(shù)和組織病理學(xué)確診為喉癌的64例患者作為研究組，選擇同期入院體檢存在聲帶息肉的患者61例作為對(duì)照組。研究組男性35例，女性29例，年齡36～78歲，平均年齡(48.81±5.29)歲；對(duì)照組男性34例，女性27例，年齡34～76歲，平均年齡(48.23±5.36)歲。2組患者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)手術(shù)或組織病理學(xué)確診為喉癌，在術(shù)前未接受過(guò)化療或放療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有咽喉部位其它炎性疾病、惡性腫瘤和存在手術(shù)禁忌證的患者。

1.3 主要儀器和試劑

儀器：組織包埋機(jī)、組織切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)、不銹鋼壓力鍋、電磁爐、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冷藏冰箱、光學(xué)顯微鏡、載玻片、蓋玻片等。

試劑：PD-1兔抗人單克隆抗體ab137132，PD-L1兔抗人單克隆抗體ab205921，即用型免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)，EDTA抗原修復(fù)液pH9.0，石蠟，4%多聚甲醛、乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等。

1.4 方法

所有采集的標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后切成4 μm厚度組織切片，再經(jīng)脫蠟劑脫蠟，梯度濃度乙醇脫水，蒸餾水清洗，PBS浸泡，用EDTA高溫高壓抗原修復(fù)110 s，再用3%雙氧水、封閉用山羊血清處理，加一滴1∶100兔抗人PD-1和PD-L1，置于4 ℃孵育過(guò)夜，再依次加入二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記酶卵白素工作液，給予DAB顯色，鹽酸乙醇分化、反藍(lán)和脫水處理，最后用中性樹膠封片，每例實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行2次[3]。

PD-1和PD-L1在組織中陽(yáng)性顯色評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)為在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出淡黃色或棕褐色的顆粒，在腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性顯色；染色強(qiáng)度評(píng)分如下：細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒為弱染色，記1分；出現(xiàn)棕黃色顆粒為中等染色，記2分；出現(xiàn)棕褐色顆粒為強(qiáng)染色，記3分。隨機(jī)選取5個(gè)400×的視野，每個(gè)視野100個(gè)腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞中PD-1或PD-L1陽(yáng)性顯色強(qiáng)度≥2分的細(xì)胞數(shù)目≥5%時(shí)或陽(yáng)性顯色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目相乘的結(jié)果≥10%時(shí)判定為該切片陽(yáng)性表達(dá)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

光鏡下觀察可見(jiàn)研究組患者癌細(xì)胞具有明顯的結(jié)構(gòu)異型性和細(xì)胞異型性，部分高分化鱗癌可見(jiàn)角化珠，對(duì)照組患者可見(jiàn)黏膜組織水腫，鱗狀細(xì)胞仍整齊排列，無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異型性。

2.2 2組對(duì)象樣本PD-1和PD-L1的表達(dá)情況

研究組PD-1表達(dá)陽(yáng)性率為62.50%，明顯高于對(duì)照組8.20%；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為68.75%，明顯高于對(duì)照組13.11%，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 2組對(duì)象樣本PD-1和PD-L1的表達(dá)情況(例，%)

2.3 研究組樣本PD-1和PD-L1表達(dá)情況的相關(guān)性分析

64例研究組患者中40例PD-1陽(yáng)性表達(dá)的喉癌組織有37例為PD-L1陽(yáng)性表達(dá)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)可知喉癌組織中PD-1和PD-L1表達(dá)呈明顯的正相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 研究組樣本PD-1和PD-L1表達(dá)情況的相關(guān)性分析

2.4 喉癌組織PD-1和PD-L1表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系

PD-1、PD-L1表達(dá)和喉癌臨床分期和腫瘤分化程度密切相關(guān)，與患者癌組織發(fā)生部位無(wú)關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 喉癌組織PD-1和PD-L1表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

PD-1又名CD279，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，能夠抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，其實(shí)質(zhì)為位于淋巴細(xì)胞表面的受體蛋白，主要位于T淋巴細(xì)胞表面，具有負(fù)向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性的功能，抑制T淋巴細(xì)胞增殖、分化，減少相關(guān)細(xì)胞因子的合成和分泌。PD-1有2種結(jié)合配體，分別為PD-L1和PD-L2，又名CD274，屬于B7家族的成員之一，在活化的T、B細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞表面廣泛的表達(dá)；PD-L2為CD273，主要表達(dá)于活化的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面，因此PD-L1在體內(nèi)發(fā)揮的作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)PL-L2[5]。機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，主要是由催化劑和抑制劑之間通路的調(diào)節(jié)活動(dòng)達(dá)到平衡，其中PD-1和PD-L1是其中的一種抑制劑，能夠抑制腫瘤特異性的T細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)，介導(dǎo)免疫逃逸機(jī)制[6]。

正常機(jī)體組織很少在細(xì)胞表面表達(dá)PD-L1蛋白，說(shuō)明其轉(zhuǎn)錄是在機(jī)體生理免疫系統(tǒng)的嚴(yán)密監(jiān)控下進(jìn)行的，已經(jīng)有研究證實(shí)，γ-IFN、TNF、IL-4、IL-10等多種細(xì)胞因子能夠上調(diào)PD-L1在不同細(xì)胞中的表達(dá)，而且PD-1和PD-L1在多種惡性腫瘤患者中的表達(dá)率明顯升高，而且其表達(dá)情況與部分惡性腫瘤的TNM分期和預(yù)后密切相關(guān)[7]。本次研究結(jié)果顯示，喉癌患者PD-1表達(dá)陽(yáng)性率為62.50%，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為68.75%，和對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而且兩者之間的表達(dá)呈明顯的正相關(guān)性，PD-1和PD-L1在喉癌組織的表達(dá)程度與患者癌癥臨床分期和癌組織分化程度密切相關(guān)，臨床分期越高、組織分化程度越高，陽(yáng)性表達(dá)率越高，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-9]。由此可以證實(shí)，PD-1和PD-L1在喉癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用，其中PD-L1可能減弱T細(xì)胞的功能和細(xì)胞凋亡，與機(jī)體內(nèi)其他蛋白相互作用達(dá)到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，其信號(hào)通路可能與激活絲裂原活化蛋白激酶-分裂原活化抑制劑(MAPK-MEK)途徑、表皮生長(zhǎng)因子受體途徑(EGFR)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子途徑、C-JUN途徑、鈣離子信號(hào)途徑和核轉(zhuǎn)錄因子途徑有關(guān)[10]。

綜上所述，PD-1和PD-L1在喉癌患者癌組織中具有較高的陽(yáng)性表達(dá)率，兩者表達(dá)呈明顯的正相關(guān)，患者表達(dá)情況與其臨床TNM分期和癌組織分化程度密切相關(guān)，可將其作為喉癌發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。