馮 欽 洪晨善 魏曉龍 曾蕓珠 許少偉 彭漢偉

口腔癌在我國發(fā)病率并不高，但預后較差?？谇话┮憎[狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)最常見，約占90%[1]。目前OSCC的治療以手術±放/化療為主，總的5年生存率約50%～70%[2]。PTEN作為第一個被發(fā)現(xiàn)具有雙磷酸酶活性的抑癌基因在細胞周期G1期的負性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[3]；而Cyclin D1則是細胞周期G1/S期中重要的正性調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[4]，兩者共同參與細胞的有絲分裂并影響細胞功能。有研究發(fā)現(xiàn)PTEN和Cyclin D1在腫瘤組織中表達水平的高低與OSCC患者的臨床病理特征之間有密切的關系[5-6]，而PTEN和Cyclin D1在OSCC組織中的表達與預后關系的報道較少。本研究通過免疫組化的方法檢測手術存檔的原發(fā)灶石蠟標本中PTEN和Cyclin D1蛋白表達，探索上述基因的表達及其與的預后關系，為評估OSCC的預后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象納入標準

2014年12月至2016年12月汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院頭頸科共收治OSCC 216例，選擇其中符合下列標準者78例作為研究對象：①病理確診口腔鱗癌；②在我院接受根治性手術±放療治療者；③術前未進行放化療或生物治療；④術前評估無遠處轉(zhuǎn)移者；⑤病例資料完整。

1.2 臨床資料收集

78例口腔鱗癌患者中，男性48例，女性30例；中位年齡60歲(34～83歲)；原發(fā)部位包括口頰8例，舌44例，口底11例，牙齦13例，硬腭2例。吸煙標準：吸煙指數(shù)≥200，飲酒標準：平均每次飲白酒量300克以上，每周1次以上，連續(xù)10年以上。按照國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合會(UICC/AJCC)分期標準系統(tǒng)第7版進行分期，其中T117例、T231例、T321例，T49例；N059例，N17例、N211例、N31例；Ⅰ期13例，Ⅱ期26例，Ⅲ期21例，Ⅳ期18例；高分化64例，中分化12例，低分化2例。單純手術治療67例，術后輔助放/化療11例。

1.3 免疫組化

實驗試劑：PTEN及Cyclin D1單克隆抗體和廣譜超敏SP試劑盒購自福建邁新公司。方法：按照操作說明書和免疫組化常規(guī)方法完成。PBS液代替一抗做陰性對照。用已知PTEN及Cyclin D1蛋白陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判讀

免疫組化計數(shù)由2位副高以上病理科醫(yī)師獨立進行。Cyclin D1以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，反之陰性，PTEN以胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，反之陰性。著色強度分為4級：0為未著色，1為淺棕色，2為棕色，3為深棕色。著色密度分為5級：0為未著色，1為著色細胞率<20%，2為著色細胞率21%～40%，3為著色細胞率41%～60%，4為著色細胞率>60%。著色強度與密度級數(shù)和：0為(-)，不表達；1～3為(+)，低表達；4～5為(++)，中表達；6～7為(+++)，高表達。

1.5 隨訪

全組78例，獲隨訪76例，失訪2例，隨訪率97%；隨訪截止日期為2019年3月31日?？偵?OS)時間定義為疾病確診至任何原因引起的死亡間隔時間。無病生存(DFS)時間定義為從疾病確診至腫瘤復發(fā)或腫瘤所致的死亡的間隔時間，非腫瘤原因所致死亡記錄為刪失數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 23軟件進行分析。PTEN和Cyclin D1間表達與臨床病理特征之間的相關性采用Spearman檢驗，采用Kaplain-Meier法做復發(fā)及生存曲線，并用Log-rank檢驗進行組間比較，采用Cox比例風險模型進行預后多因素分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN和Cyclin D1在口腔鱗癌組織中的表達情況

PTEN和Cyclin D1在OSCC中表達率為100%，其中PTEN高表達22例(28.2%)，中表達47例(60.3%)，低表達9例(11.5%)；Cyclin D1高表達39例(50%)，中表達29例(37.2%)，低表達10例(12.8%)。

2.2 PTEN表達與Cyclin D1表達的相關性及其臨床病理特征的相關性

Spearman相關性分析結(jié)果顯示：PTEN表達與cyclin D1表達無統(tǒng)計學相關(γ=0.114，P=0.320)(表1)；PTEN表達與Cyclin D1表達均與OSCC患者的年齡、組織分化、吸煙、飲酒、復發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤是否浸潤包膜、血管及神經(jīng)、T分期、術后病理分期無統(tǒng)計學相關，P均>0.05。

表1 口腔鱗癌患者PTEN和Cyclin D1表達相關性分析/例

2.3 PTEN表達和Cyclin D1表達與患者預后的關系

全組失訪2例，隨訪率97.4%，中位隨訪時間33個月(5～51個月)。全組的78例中復發(fā)29例，其中原發(fā)灶復發(fā)15例，頸部復發(fā)8例，遠處轉(zhuǎn)移4例，原發(fā)灶及頸部同時復發(fā)2例；死亡26例，其中23例死于腫瘤復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，1例死于放療后第二原發(fā)頸段食管癌，2例死因不明；存活52例，1例帶瘤生存，1例放療后第二原發(fā)癌治療中。

全組3y-OS為65.4%，3y-DFS為53.8%。PTEN高、中、低表達組患者的3y-OS分別為75.0%、61.4%、55.6%(P=0.095)，3y-DFS分別為51.1%、52.9%、55.6%(P=0.367)，差異均不具有統(tǒng)計學意義(圖1)。Cyclin D1高、中、低表達組患者的3y-OS分別為65.3%、69.0%、60.0%(P=0.918)，3y-DFS分別為55.1%、54.5%、50.0%(P=0.993)，差異均不具有統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.4 影響患者預后的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，吸煙(OS：P=0.020，DFS:P=0.040)、飲酒(OS：P=0.018,DFS:P=0.087)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OS：P=0.050；DFS:P=0.018)和術后病理分期(OS：P=0.007；DFS:P=0.057)是影響患者OS和DFS的相關因素(表2)。

將影響生存的可能因素包括年齡、吸煙、飲酒、術后病理分期、組織分化、PTEN表達和Cyclin D1表達等，采用Enter法引入Cox比例風險模型中進行多因素分析，結(jié)果顯示PTEN低表達(P=0.046)和Cyclin D1高表達(P=0.011)是影響患者無病生存的不良預后因素，PTEN低表達(P=0.049)也是影響患者總生存的不良預后因素(表3)。

圖1 PTEN表達對口腔鱗癌術后患者無病生存(A)和總生存(B)的影響

圖2 Cyclin D1表達對口腔鱗癌術后患者無病生存(A)和總生存(B)的影響

3 討論

389例口腔鱗癌的回顧性分析研究發(fā)現(xiàn)N分期、臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)外侵犯(ENE)與預后相關[7]。盡管上述因素在一定程度上對口腔鱗癌患者術后的預后有一定的預測作用，但是目前仍然缺乏能夠預測生存和復發(fā)概率的精準手段。為了更加精準地進行個體化治療，則需要尋找更理想的腫瘤標志物以協(xié)助治療方案決策和療效預測。

復習文獻發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重活性，可以使第二信使PIP3(三磷酸磷脂酰肌醇)去磷酸化，進一步阻斷對應的細胞信號傳導通路，下調(diào)Cyclin D1的表達，而后者在細胞周期G1/S期中具有重要的正性調(diào)控作用，從而抑制細胞生長[5,8-9]。本研究著重探索腫瘤發(fā)生發(fā)展中兩個重要的細胞周期調(diào)控基因PTEN及Cyclin D1在OSCC病理組織中的表達，以及兩者之間的相關性和預后的價值。

有學者[5-6,10]發(fā)現(xiàn)PTEN和Cyclin D1在口腔癌組織中的表達存在異于正常組織，且與腫瘤病理分級及病理分期之間存在關聯(lián)，并指出PTEN能夠下調(diào)Cyclin D1的表達。張媛媛等[11]發(fā)現(xiàn)Cyclin D1過表達與組織低分化和促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。相反，有研究[12]結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)頭頸鱗癌組織中有Cyclin D1的過表達。王心蕊等[13]認為PTEN 基因突變在頭頸部癌癥的過程中可能不起主導作用。但是，關于上述兩者在OSCC患者中的表達及其預后的關系相關研究報道較少。

表2 影響口腔鱗癌患者生存的單因素分析/%

本研究以未經(jīng)誘導化療、放療或生物治療，直接接受手術±放/化療的OSCC78例為研究對象，通過免疫組化法檢測原發(fā)灶組織中PTEN蛋白和Cyclin d1蛋白的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例中PTEN及Cyclin D1均有不同水平的表達，PTEN表達水平和Cyclin D1表達水平之間，以及它們和臨床病理參數(shù)之間無統(tǒng)計學相關，這與部分國外[10]和國內(nèi)[5-6,14]的報道不一致。在本研究實驗操作嚴格按照操作說明書和免疫組化常規(guī)方法完成蛋白的檢測和雙盲讀片，并且設有陽性和陰性對照，石蠟標本保存時間不長，重復檢測結(jié)果一致；但是樣本量相對較少而且解剖亞區(qū)分布較廣可能導致統(tǒng)計學偏倚。當然，上述其他學者的研究多為回顧性且入組病例數(shù)量也并不多。因而，我們認為PTEN表達和Cyclin D1表達的相關性尚有待加大樣本量優(yōu)化研究設計進一步探索。

在預后價值上，Pickhard等[12]回顧性分析180例頭頸鱗癌病例，結(jié)果顯示的PTEN 的表達與預后無關。另一項來自Lee等[15]學者的研究也發(fā)現(xiàn)PTEN在舌癌中的表達降低，但是未發(fā)現(xiàn)PTEN 低表達的患者其OS和DFS有明顯下降。相反，Snietura等[16]認為PTEN也許能作為一種有價值的頭頸部鱗狀細胞癌術后放療的預后指標。Baghaei等[17]一項49例口腔鱗癌病例的回顧性分析表明PTEN的低表達很可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要影響。同樣，關于Cyclin D1的表達對預后影響的研究結(jié)果也不一致，Pickhard A等的研究結(jié)果顯示Cyclin D1過表達的患者預后較差，但無統(tǒng)計學意義(P=0.065)。其他研究[18]結(jié)果也發(fā)現(xiàn)沒有證據(jù)支持Cyclin D1蛋白可作為預后因子。然而Gioacchini等[19]分析研究證明Cyclin D1的過表達與高T分期、N分期和臨床分期等不良預后因素均有關，是口腔鱗癌患者預后的潛在重要指標。

表3 影響口腔鱗癌患者生存的多因素分析

我們的研究發(fā)現(xiàn)：單因素分析中PTEN的高表達OSCC患者的OS優(yōu)于低表達組和中表達組，但是不具有統(tǒng)計學意義(P=0.095)，PTEN 的表達水平不影響患者的DFS(P=0.367)；Cyclin D1的表達水平與OSCC患者的預后無統(tǒng)計學相關(OS：P=0.918；DFS:P=0.993)。然而，當我們將年齡、吸煙、飲酒、術后病理分期、組織分化、PTEN表達和Cyclin D1表達等相關臨床病理因素進行多因素Cox模型分析時發(fā)現(xiàn)PTEN低表達是影響OSCC患者OS和DFS的獨立不良預后因素，Cyclin D1高表達則是影響患者DFS的獨立不良預后因素。

鑒于PTEN和Cyclin D1在Kaplain-Meier生存分析中、兩者之間和與OSCC患者的臨床病理參數(shù)之間均缺乏統(tǒng)計學相關，我們推測主要是因為病例數(shù)不足及隨訪時間過短所致。本組病例Ⅰ期～Ⅱ期3年OS為81.4%，Ⅲ期～Ⅳ期3年OS為51.4%(P=0.007)，N0組與N+組的3年OS分別為71.9%和47.4%(P=0.050)，各組預后趨勢顯著，進一步說明上述分析是合理的。

綜上所述，本隊列研究結(jié)果提示，在行手術±放療治療的OSCC中，PTEN表達和Cyclin D1表達可能缺乏統(tǒng)計學相關性，PTEN低表達和Cyclin D1高表達是影響OSCC生存的獨立不良預后因素，對OSCC患者的預后判斷有一定的價值。確切的結(jié)論尚有待加大樣本量優(yōu)化研究設計進一步探索。