李 妍 趙振慧 李 迅

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一[1]，雖然近年來乳腺癌的治療和診斷都有了顯著的提高，但是腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后較差等問題仍然存在[2]。并且介導(dǎo)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制研究并不完善，所以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤生物標志物，并完善其分子機制對于臨床的診斷和治療至關(guān)重要。MicroRNA(miRNA)是一類長度約為20～24個核苷酸的小RNA，可通過抑制其靶基因的表達水平而調(diào)控生物體內(nèi)多種生物學(xué)進程，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。在腫瘤相關(guān)的MicroRNA中，miR-1247-3p已經(jīng)被報道在肝癌等癌癥高表達[4]，但是其在乳腺癌的表達和作用并沒有報道，本研究通過探究miR-1247-3p在乳腺癌中的表達及對乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的影響，旨在為乳腺癌的研究和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞株MCF7和MDA-MB-231(由新疆醫(yī)科大學(xué)提供)；乳腺上皮細胞MCF10A(由新疆醫(yī)科大學(xué)提供)；Tirzol(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；CCK8試劑盒(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；EvaGreen miRNA qPCR試劑盒、miRNA cDNA Synthesis 試劑盒(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；B4GALT3，GAPDH抗體，山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；電泳儀(南京大學(xué)儀器廠)；微型垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；Transwell小室(福麥斯生物技術(shù)有限公司)，miR-1247-3p引物、mimic、inhibitor、negative control、B4GALT3的siRNA(由吉瑪基因有限公司合成)；轉(zhuǎn)染試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

乳腺癌細胞和乳腺上皮細胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，每1至2天細胞換液或傳代。取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231接種于六孔板中，每孔細胞數(shù)為1×105，按照轉(zhuǎn)染試劑盒指示，將miR-1247-3p的mimic、inhibitor、negative control(NC)或者 B4GALT3的siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，然后在不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中與MCF7和MDA-MB-231共孵育8h，再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 乳腺癌細胞中RNA的提取

培養(yǎng)乳腺癌細胞和乳腺上皮細胞至密度為80%，消化細胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，取上述細胞裂解液加入200 μl氯仿，靜置5 min后，于12 000×g，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入500 μl異丙醇，12 000×g，4 ℃離心10 min，去上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量儀檢測總RNA含量。

1.4 RT-qPCR檢測乳腺癌細胞中miR-1247-3p的表達水平

根據(jù)miRNA cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應(yīng)體系，將提取的乳腺癌細胞RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用核酸定量儀對cDNA進行定量。然后根據(jù)EvaGreen miRNA qPCR試劑盒指示配置反應(yīng)體系，進行qPCR反應(yīng)，采用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)后采用2-ΔΔCt法計算miR-1247-3p的表達量。

1.5 細胞增殖實驗

消化轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞，稀釋細胞至50000個/ml，將上述細胞接種至96孔板，每孔100 μl，每組三個復(fù)孔，并將細胞培養(yǎng)2～4 h，使乳腺癌細胞完全貼壁，然后每孔加入10 μl的CCK8溶液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細胞增殖能力越強。

1.6 細胞劃痕實驗

消化轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞，稀釋細胞至300000個/ml，然后將各組細胞分別接種至96孔板，每孔30000個細胞，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)至細胞完全貼壁，然后用無菌的白色槍頭在96孔板的中央輕輕劃痕，劃痕后立即用PBS清洗細胞，并在每孔加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h后觀察并拍照，計算劃痕愈合率，劃痕愈合率越高，細胞遷移能力越強。

1.7 細胞侵襲實驗

4 ℃融化Matrigel膠，每個Transwell小室加入100 μl Matrigel膠，輕輕搖晃使膠在小室底部覆蓋均勻，37 ℃培養(yǎng)箱中放置30 min，使Matrigel膠充分凝固。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細胞，并稀釋細胞至5000個/200 μl，并取200 μl細胞接種至Transwell小室中，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl完全培養(yǎng)基，使小室底部浸入培養(yǎng)基，將24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用無水乙醇固定30 min，晾干后用結(jié)晶紫對小室底部染色10 min，清洗晾干后，在顯微鏡下觀察拍照，每孔拍5張照片，并用Photoshop軟件計數(shù)，比較各組侵襲的細胞數(shù)目，細胞數(shù)目越多，細胞侵襲能力越強。

1.8 miR-1247-3p靶基因的預(yù)測

在miRDB和microT-CD兩個數(shù)據(jù)庫中分別查找miR-1247-3p的靶基因，取兩個數(shù)據(jù)庫中的靶基因的交集，并使用Targetscan軟件根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的信息對靶基因進行置信水平分析，取置信水平最高的靶基因。

1.9 熒光素酶報告實驗驗證靶基因

采用熒光素酶報告實驗鑒定預(yù)測到的靶基因和miR-1247-3p的靶向關(guān)系，具體步驟為：設(shè)計pGL3質(zhì)粒載體，將靶基因構(gòu)建在熒光素酶基因的前邊，將空白pGL3質(zhì)粒(pGL3-Control)、含靶基因pGL3質(zhì)粒(pGL3-B4GALT3 WT)、以及陰性對照pGL3質(zhì)粒(pGL3-B4GALT3 MUT)(質(zhì)粒的設(shè)計和構(gòu)建由廣州博瑞生物有限公司完成)轉(zhuǎn)染進入293T細胞，并且將miR-1247-3p的mimic及NC轉(zhuǎn)染至上述293T細胞，培養(yǎng)24 h后，使用Dual Luciferase 試劑盒檢測熒光強度，若miR-1247-3p能夠與靶基因結(jié)合，則抑制下游熒光素酶的表達，熒光強度降低。

1.10 Western blot檢測乳腺癌細胞中B4GALT3表達水平

取各組轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimic、inhibitor、NC后的乳腺癌細胞加入1 ml的Trizol研磨均勻，加入1.5 ml的異丙醇，12 000×g，4 ℃離心10 min，去上清，用蛋白清洗液清洗3次后，用1%的SDS溶液重懸沉淀，即為總蛋白。BCA蛋白定量后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對PVDF膜封閉2 h，然后以稀釋后的GAPDH、B4GALT3一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件曝光結(jié)果進行定量分析。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 qPCR檢測乳腺癌細胞miR-1247-3p的表達水平

根據(jù)qPCR檢測結(jié)果(圖1)：miR-1247-3p在乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231的表達量顯著高于乳腺上皮細胞中的表達量(P<0.001)，提示乳腺癌細胞或可通過高表達miR-1247-3p而促進其自身的生長。

圖1 qPCR檢測miR-1247-3p在乳腺癌細胞及乳腺上皮細胞中的表達水平

2.2 miR-1247-3p促進乳腺癌細胞的增殖能力

如圖2所示：轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimic的乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231的OD值顯著高于對照組，而轉(zhuǎn)染miR-1247-3p inhibitor的乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231的OD值顯著低于對照組，提示miR-1247-3p表達上調(diào)可顯著提高乳腺癌細胞的體外增殖能力。

2.3 miR-1247-3p促進乳腺癌細胞遷移能力

細胞劃痕檢測乳腺癌細胞遷移能力結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimic后MCF7和MDA-MB-231的劃痕愈合率顯著提高(P<0.001)；轉(zhuǎn)染miR-1247-3p inhibitor后MCF7和MDA-MB-231的劃痕愈合率顯著降低(P<0.001)，提示miR-1247-3p能夠在體外顯著提高乳腺癌細胞的遷移能力。

2.4 miR-1247-3p促進乳腺癌細胞侵襲能力

細胞侵襲檢測結(jié)果(圖4)顯示：相比于NC組，miR-1247-3p mimic組細胞數(shù)目顯著增加(P<0.001)，而inhibitor組則顯著減少(P<0.001)，提示miR-1247-3p能夠顯著促進乳腺癌細胞的侵襲能力。

2.5 miR-1247-3p靶基因預(yù)測結(jié)果

根據(jù)miRDB和microT-CD數(shù)據(jù)庫篩選并評價miR-1247-3p靶基因結(jié)果，選取置信度最高的B4GALT3，并且預(yù)測到 miR-1247-3p與B4GALT3mRNA的結(jié)合區(qū)域。

2.6 熒光素酶報告實驗驗證靶基因結(jié)果

熒光素酶報告實驗結(jié)果(圖5)顯示：miR-1247-3p mimic能夠使pGL3-B4GALT3 WT組熒光強度顯著下降(P<0.001)，而pGL3-Control組和pGL3-B4GALT3 MUT組熒光強度無顯著變化，說明B4GALT3為miR-1247-3p的靶基因。

2.7 miR-1247-3p抑制乳腺癌細胞B4GALT3表達水平

Western blot結(jié)果(圖6)顯示：相比于NC組，轉(zhuǎn)染miR-1247-3p mimic的MCF7和MDA-MB-231細胞B4GALT3表達顯著降低(P<0.001)；而 miR-1247-3p inhibitor組表達顯著升高(P<0.001)；說明miR-1247-3p能夠顯著抑制乳腺癌細胞B4GALT3表達水平。

2.8 下調(diào)B4GALT3促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

如圖7、8、9所示，當轉(zhuǎn)染siRNA抑制B4GALT3表達時，乳腺癌細胞MCF7和MDA-MB-231的增殖能力顯著上升；細胞劃痕愈合能力顯著上升；細胞侵襲數(shù)目亦顯著上升；說明B4GALT3表達量下調(diào)能夠促進乳腺癌細胞的增殖、遷移以及侵襲能力；而miR-1247-3p能夠顯著下調(diào)B4GALT3的表達水平，提示miR1247-3p能夠通過下調(diào)其靶基因B4GALT3的表達而促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的能力。

圖2 CCK8檢測MCF7和MDA-MB-231增殖能力

圖3 細胞劃痕檢測MCF7和MDA-MB-231遷移能力

圖4 細胞侵襲能力檢測結(jié)果

圖5 熒光素酶報告實驗預(yù)測靶基因結(jié)果

3 討論

乳腺癌作為1種高發(fā)于女性的癌癥，是女性癌癥死亡的第二大原因，預(yù)后較差，平均5年的生存率僅為27%[5-7]；臨床上的化療、放療等治療雖然可以控制腫瘤的原位生長[8]，但是對腫瘤的轉(zhuǎn)移的治療效果并不顯著，尤其時在預(yù)防和防止復(fù)發(fā)方面更是存在巨大的挑戰(zhàn)，因此尋找到新的參與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的生物標志物，為臨床的診斷和治療提供新的思路至關(guān)重要。miRNA是一類內(nèi)源性的[9]，由20～24個核苷酸組成的非編碼RNA，其作用機制主要是通過結(jié)合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表達[10]，在基因的表達中起到負調(diào)控的作用，且人類基因組中約1/3的編碼基因受miRNA的調(diào)控[11]，近年來逐漸有研究表明，腫瘤組織中miRNA的差異表達是造成腫瘤發(fā)展的重要原因[12]；而在本研究發(fā)現(xiàn)miR-1247-3p在乳腺癌細胞中顯著高表達，提示miR-1247-3p可能在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

本研究通過CCK8法檢測乳腺癌細胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)過表達miR-1247-3p能夠顯著提高乳腺癌細胞的增殖能力，低表達miR-1247-3p則抑制；通過細胞劃痕實驗評價乳腺癌細胞的體外遷移能力，發(fā)現(xiàn)過表達miR-1247-3p乳腺癌細胞的遷移能力顯著提高；并且通過細胞侵襲實驗也發(fā)現(xiàn)過表達miR-1247-3p促進乳腺癌細胞的侵襲能力。

為進一步探究miR-1247-3p促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制，本研究通過生物信息學(xué)的預(yù)測并通過熒光素酶實驗驗證其靶基因為B4GALT3，且Western blot檢測結(jié)果表明過表達miR-1247-3p能夠抑制B4GALT3的表達；目前，B4GALT3已經(jīng)被報道在肝癌中發(fā)揮促癌作用[13]，但其在乳腺癌中的作用尚未有詳細報道，而本研究首次發(fā)現(xiàn)抑制B4GALT3的表達能夠促進乳腺癌細胞增殖、遷移以及侵襲的能力。

圖6 Western blot檢測B4GALT3表達水平

圖7 下調(diào)B4GALT3促進乳腺癌細胞的增殖

圖8 下調(diào)B4GALT3促進乳腺癌細胞劃痕愈合

圖9 下調(diào)B4GALT3促進乳腺癌細胞的遷移能力

綜上所述，miR-1247-3p可通過抑制B4GALT3的表達而促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，但是其下游的精細機制還需進一步探討。