李宗國，時召平，張鵬飛

（承德市中醫(yī)院藥學(xué)部，河北承德 067000）

腎小球系膜增生是系膜增生性腎小球腎炎的主要病理表現(xiàn)，系膜細胞外基質(zhì)增多是引起腎小球病變的主要病理機制[1]。有研究顯示，細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶家族是降解細胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，具有分解基質(zhì)中明膠及膠原的作用[2]?；|(zhì)蛋白酶家族中的基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種IV型膠原酶，能降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）中的變性I型膠原及IV型膠原為主的基膜[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）可參與細胞內(nèi)信號傳遞過程，其轉(zhuǎn)錄表達異?？商崾鹃g質(zhì)性腎炎、腎細胞癌等多種腎病[4]。目前，西醫(yī)治療系膜增生性腎小球腎炎主要采用激素類藥物，但因患者個體差異，臨床應(yīng)用時具有較明顯副反應(yīng)。我國中醫(yī)根據(jù)系膜增生性腎小球腎炎臨床癥狀，將其歸為血尿、腎性水腫類疾病，此類疾病因機體氣血不通，氣機失常，水、氣、血運輸受阻，形成水腫、淤血，血瘀累積至腎，引起腎間質(zhì)纖維化等病變。中醫(yī)認為黃芪具有健脾益氣、活血化瘀、保腎養(yǎng)血功效，在治療腎病時有明顯療效[5]。黃芪主要有效成分包括黃芪多糖、黃芪甲苷、氨基酸、黃酮，其中的多糖成分可作為免疫促進劑，具有抗腫瘤、抗病毒作用，黃芪甲苷在一定濃度內(nèi)可阻止細胞周期進程。此外，水蛭入藥后具有破血逐淤、消痰飲功效，其唾液中有效成分的水蛭素具有較強抑制血栓作用[6]。本研究通過對小鼠腎小球系膜細胞（mouse glomerular mesangial cells，MgCs）應(yīng)用中藥黃芪、水蛭中不同有效成分進行培養(yǎng)，觀察兩者對系膜細胞增殖及MMP-9、NF-κB水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

昆明種小鼠，體重18～22g，雌性，合格證號：01-3001，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所繁育場。小鼠隨機分為正常組、模型組、黃芪多糖組、黃芪甲苷組、水蛭素組，每組5只。

1.2 試劑來源

脂多糖（北京索來寶，貨號：L8880-10mg）；黃芪多糖（恒瑞康生物科技公司）；水蛭素凍干粉（西安百川生物科技有限公司，貨號：XABC-524）；黃芪甲苷溶液（Aladdin公司）；Cell Counting Kit-8試劑盒（北京百奧萊博，貨號：YT127）。

1.3 含藥血清小鼠模型的制備

小鼠給藥劑量參照相關(guān)文獻提供的實驗動物與人臨床用藥劑量換算公式。各干預(yù)組分別給以黃芪多糖、黃芪甲苷、水蛭素4ml/200g/d灌胃，其他組予等劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)5d。于末次給藥2h后，取10%水合氯醛腹腔麻醉，在無菌條件下，自頸動脈取血，離心滅菌后，于-70℃低溫冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞培養(yǎng)

1.4.1 小鼠MgCs的原代培養(yǎng)及鑒定 選取18～22g 健康雌性昆明種小鼠，在無菌條件下取小鼠腎小球毛細血管間的系膜，剝離除去外周結(jié)締組織，刮除內(nèi)膜，將中膜層組織用預(yù)冷的 PBS 沖洗后剪成小塊，接種于培養(yǎng)瓶。細胞置于 10% LPS 的 DMEM 低糖培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將接近融合的原代培養(yǎng)細胞消化，按 1∶2 傳代。取 4～6 代MgCs用于實驗。

1.4.2 篩選LPS促進MgCs增殖的最適條件 調(diào)整對數(shù)生長期的MgCs細胞數(shù)為6×104/cm2接種至96孔板，細胞過夜貼壁后，無血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)24h，吸去培養(yǎng)基，加入不同濃度LPS（0%、5%、10%、20%、30%、40%）誘導(dǎo)MgCs增殖，分別培養(yǎng)24、48、72 h。采用CCK8法檢測MgCs增殖情況，鏡下觀察到系膜細胞貼壁生長且呈梭型，表示MgCs增生成功，確定LPS添加濃度為30%。

1.5 預(yù)先制備試劑

將10mg脂多糖溶于5ml生理鹽水中，制成脂多糖溶液。將0.5g黃芪多糖溶于10ml生理鹽水中，制成黃芪多糖溶液。將100ATU水蛭素凍干粉溶于2ml生理鹽水，制成水蛭素溶液。黃芪甲苷溶液購自Aladdin公司。

1.6 細胞增殖實驗

使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒培養(yǎng)細胞12h后，向黃芪多糖組、黃芪甲苷組、水蛭素組中分別加入500μg/ml黃芪多糖溶液、40μg/ml黃芪甲苷溶液、10μg/ml水蛭素溶液。繼續(xù)于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后收集細胞。

1.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

將待測細胞制成1×106個/m l的懸液，分別用Annexin V-fluorescein isothiocyanate（FITC）、碘化丙啶（propidiumiodide，PI）避光染色15min。使用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測。

1.8 實時熒光定量PCR檢測基因表達

使用TRIzol試劑從細胞組織中分離總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總共2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，引物序列如下。MMP-9：正向5’- ATCCCTCAACATCGCAACTGT-3’，反向5’-CAGC-CTCTGGTAGATTATCAAGC-3’；NF-κB：正向5’-CCAGATCAATGGCTACAC GG-3’，反向5’-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3’；β-Actin：正向5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，反向5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。使用 SYBR Green PCR Master Mix 在 7500 Fast Real-Time PCR System中，以10μl的終體積進行定量PCR。PCR在以下條件下進行：50℃2min，隨后94℃Taq酶活化30s，95℃ 15s，60℃ 1min，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示基因表達水平。

1.9 免疫細胞化學(xué)法檢測基因表達

各組細胞藥物作用48h后，4%多聚甲醛固定，0.5%Triton-100通透細胞，3% H2O2去除過氧化物酶，10%山羊血清室溫封閉，一抗 4℃濕盒孵育過夜。陰性對照組加PBS代替一抗，生物素化二抗孵育，鏈霉菌抗生素-過氧化物酶溶液孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。采用免疫細胞化學(xué)分析法測定MMP-9、NF-κB蛋白表達水平。采用免疫細胞化學(xué)分析法測定MMP-9、NF-κB蛋白表達水平，結(jié)果如圖1和圖2所示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料多組間比較單因素方差分析，方差不齊的計量資料采用Kruskal-Wallis檢驗，以（）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細胞凋亡率增高

經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)增生后，加入黃芪多糖培養(yǎng)的黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細胞凋亡率均高于模型組與正常組（P＜0.05），見表1：

表1 各組小鼠凋亡率比較Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

表1 各組小鼠凋亡率比較Tab.1 Comparison of apoptosis rate of mice in each group （）

組別 凋亡率正常組模型組 7.85±0.36% 13.56±0.79%黃芪多糖組 28.74±1.23%黃芪甲苷組 25.31±1.38%水蛭素組 36.25±1.65%F 480.810 P＜0.001

2.2 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細胞MMP-9蛋白表達降低

MMP-9定位于細胞質(zhì)，各干預(yù)組MMP-9蛋白表達均明顯低于模型組（P＜0.05），但高于正常組（P＜0.05）；各干預(yù)組之間兩兩比較無顯著差異（P＞0.05），見表2：

表2 各組小鼠MMP-9免疫細胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

表2 各組小鼠MMP-9免疫細胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of immunocytochemical results of MMP-9 in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 MMP-9（%）正常組 1.53±0.42模型組 65.31±8.84a黃芪多糖組 48.64±3.62ab黃芪甲苷組 47.31±3.28ab水蛭素組 38.47±3.25ab F 143.050 P＜0.001

2.3 黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細胞NF-κB蛋白表達降低

NF-κB定位于細胞質(zhì)，各干預(yù)組系膜增生較少，NF-κB蛋白表達均顯著低于模型組，但高于正常組（P＜0.05）；各干預(yù)組之間兩兩比較無顯著差異（P＞0.05），見表3：

表3 各組小鼠NF-κB免疫細胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

表3 各組小鼠NF-κB免疫細胞化學(xué)結(jié)果比較Tab.3 Comparison of immunocytochemical results of NFκB in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB（%）正常組 1.95±0.34模型組 29.18±8.56a黃芪多糖組 17.42±2.15ab黃芪甲苷組 16.78±2.36ab水蛭素組 11.18±1.83ab F 32.100 P＜0.001

2.4 各組小鼠MMP-9 mRNA的PCR檢測結(jié)果比較

各干預(yù)組MMP-9 mRNA明顯低于正常組及模型組（P＜0.05）；組內(nèi)兩兩比較無顯著差異（P＞0.05），見表4：

表4 各組小鼠MMP-9 mRNA PCR檢測結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

表4 各組小鼠MMP-9 mRNA PCR檢測結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the results of MMP-9 mRNA PCR in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 MMP-9正常組 1.00±0.00模型組 8.42±0.91a黃芪多糖組 0.23±0.05ab黃芪甲苷組 0.25±0.03ab水蛭素組 0.14±0.02ab F 385.100 P＜0.001

2.5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測結(jié)果比較

各干預(yù)組MMP-9 mRNA明顯低于正常組及模型組（P＜0.05）；組內(nèi)兩兩比較無顯著差異（P＞0.05），見表5：

表5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測結(jié)果比較Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

表5 各組小鼠NF-κBmRNA PCR檢測結(jié)果比較Tab.5 Comparison of PCR results of NF-κB mRNA in mice of each group

注：a.與正常組比較，P＜0.05；b.與模型組比較，P＜0.05

組別 NF-κB正常組 1.00±0.00模型組 2.42±0.19a黃芪多糖組 0.51±0.03ab黃芪甲苷組 0.52±0.04ab水蛭素組 0.34±0.01ab F 479.190 P＜0.001

3 討論

系膜增生性腎小球腎炎以彌漫性腎小球系膜細胞增生及系膜細胞外基質(zhì)增多為典型特征[8]。胃腸、呼吸道黏膜感染導(dǎo)致的機體免疫功能降低，是系膜增生性腎小球腎炎的重要病因?；颊甙l(fā)病后會逐漸出現(xiàn)腎功能受損、腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化等病理改變。因機體免疫功能降低，大量炎癥因子釋放，會加速腎小球損傷進程。同時，炎癥因子的釋放還可促進NF-κB活化，被激活后的NF-κB亦可誘導(dǎo)炎癥因子釋放，兩者相互促進，使腎臟進一步受損[9]。因此推測，通過調(diào)節(jié)NF-κB表達水平，可調(diào)控系膜增生性腎小球腎炎發(fā)展進程。細胞外基質(zhì)沉積增多是系膜細胞增生的基礎(chǔ)病理變化，細胞外基質(zhì)的合成與降解過程受MMP家族及其組織抑制因子調(diào)節(jié)[10]。MMP家族中的MMP-9除具有降解細胞外基質(zhì)作用外，還可分解腎小球基底膜。腎小球基底膜是維持腎臟完整性的重要結(jié)構(gòu)，在腎小球濾過過程中發(fā)揮重要作用[11]。因此，MMP-9表達異?？蓪?dǎo)致腎小球功能及腎臟結(jié)構(gòu)功能受損。

近年來，對中醫(yī)方法治療腎病的臨床療效觀察已成為研究熱點。有研究證實，黃芪、丹參能降低腎小球腎炎患者尿白蛋白、血脂及血漿白蛋白水平[12]。我國中醫(yī)認為，黃芪性溫，歸脾肺經(jīng)，在治療慢性腎炎、腎病綜合征等腎病時有較好療效。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對黃芪的研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪可通過保護紅細胞，抑制血小板形成血栓，來改善腎病患者血流動力學(xué)表現(xiàn)[13]。另有研究表示，黃芪可通過抑制腎臟生長轉(zhuǎn)化因子表達，達到抑制系膜細胞增生的目的[14]。此外，水蛭作為一味常用于破血、祛瘀、通經(jīng)的傳統(tǒng)中藥，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)其含有水蛭素、多臺、肝素、抗血栓素等多種物質(zhì)[15]。其中，水蛭素是水蛭唾液中的一種抗凝血物質(zhì)，也是一種天然特效凝血酶抑制劑，有強抗血栓作用。同時，水蛭素還能抗炎癥因子，清除免疫反應(yīng)產(chǎn)物，調(diào)節(jié)免疫功能。

本研究通過體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞，經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)增生建立系膜增生性腎小球腎炎模型后，給予不同黃芪及水蛭有效成分繼續(xù)培養(yǎng)。結(jié)果顯示，黃芪多糖組、黃芪甲苷組及水蛭素組細胞凋亡率均高于模型組與正常組，說明黃芪多糖、黃芪甲苷及水蛭素均具有促進系膜細胞凋亡的作用。而且，干預(yù)組中MMP-9和NF-κB的表達均較模型組顯著降低，表明黃芪多糖、黃芪甲苷及水蛭素均可顯著抑制系膜細胞的增生。其作用機制可能是通過抑制NF-κB的表達水平，降低炎癥細胞因子釋放量，從而減輕炎癥反應(yīng)，阻止腎小球硬化或腎間質(zhì)纖維化發(fā)展進程。黃芪及水蛭中各有效成分通過抑制MMP-9表達，避免腎臟基底膜被大量降解，以保護腎臟結(jié)構(gòu)功能。但給予黃芪、水蛭不同有效成分抑制系膜增生后的MMP-9仍高于正常水平，此時升高的MMP-9可降解增多的細胞外基質(zhì)，進一步抑制系膜增生。

綜上所述，黃芪與水蛭作為中醫(yī)中具有活血化瘀、補氣養(yǎng)腎功效的重要藥物，在治療系膜增生性腎小球腎炎時具有較好效果，可于臨床使用。但本研究僅檢測了NFκB、MMP-9蛋白表達水平，未深入分析其基因與系膜細胞增生關(guān)系，筆者將在后續(xù)研究中繼續(xù)探索其對系膜增生的影響機制。