劉長兵，姚 豐，牛多山，張佐陽

（1.宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽宣城 242000；2.宣城人民醫(yī)院病理科；3.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230031）

DNA損傷會引起組蛋白翻譯后修飾的異常，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及損傷修復(fù)機(jī)制的受損[1-3]。溴區(qū)結(jié)合蛋白ZMYND8（鋅指-MYND8型蛋白）可以識別組氨酸上乙?；馁嚢彼釟埢{(diào)控一系列DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)[4-5]。研究表明，ZMYND8在腫瘤組織中可能起到抑癌基因的作用[6-7]。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中關(guān)于ZMYND8在胃癌組織中的作用和意義的研究較少。本文擬通過使用免疫組化及RT-qPCR等方法，研究ZMYND8在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理特征及胃癌患者生存率之間的關(guān)系，探討ZMYND8蛋白在預(yù)測胃癌患者預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年5月～2019年12月安徽省宣城市人民醫(yī)院收治的胃癌患者術(shù)后新鮮腫瘤及瘤旁（距腫瘤6cm）新鮮標(biāo)本30例，標(biāo)本收取后立即置入液氮罐中保存?zhèn)溆?。另選取60例具有完整臨床病理學(xué)資料及生存資料的胃癌患者腫瘤及相應(yīng)癌旁蠟塊（均經(jīng)病理證實(shí)），其中男性患者25例，女性患者35例，年齡49～65歲，平均年齡（57.1±4.9）歲；腫塊直徑小于5cm的患者36例，大于或等于5cm的患者24例；中+高分化患者27例，低分化33例；共28例患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中7例患者發(fā)生遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移，組內(nèi)其余32例患者無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期24例，Ⅲ+Ⅳ期36例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。

隨訪資料：將經(jīng)電話咨詢及郵件咨詢獲得生存資料后的胃癌患者入組，截止至2019年12月，共收集60例有效隨訪病例。

1.2 試劑和方法

1.2.1 試劑 總RNA提取試劑RNAiso plus及RT-qPCR sybrgreen I試劑盒均購自日本TAKARA公司；異丙醇、氯仿、100%乙醇等實(shí)驗耗材均購自合肥科創(chuàng)生物公司；ZMYND8及GAPDH引物由上海生工合成；RT-qPCR使用美國ABI 7500型熒光定量qPCR儀；兔抗人免疫組化用ZMYND8多克隆抗體購自美國Santa cruz公司；SABC二抗試劑盒及顯色試劑盒DAB均購自福州邁新公司。

1.2.2 RNA提取方法 從液氮罐中快速取出標(biāo)本，碾碎后立刻加入1ml Trizol并充分混勻。每個樣品加入200μl氯仿，用力震蕩后，靜置5min，12000 r/min 4℃離心10min；吸取上清至另一無酶EP管中，并加入等量異丙醇，輕輕混勻后靜置15min；12000 r/min 4℃離心10min，肉眼可見沉淀即為RNA。1ml 75%乙醇清洗RNA，12000 r/min 4℃離心10min，棄上清，空氣干燥RNA，加20μl DEPC水溶解后檢測RNA濃度。

逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄體系按照Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置，將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。

RT-qPCR：按照Takara RT-qPCRsybrgreen I試劑盒說明書配置體系。引物如下：Z M Y N D8 正向：TA A G G A G C A G G AT G G A C G G A，反向：T C T C G T T T T T G G C A A G C A G C；G A P D H 正向：G G A G C G A G AT C C C T C C A A A AT，反向：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃2min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，合計40個循環(huán)；72℃5min。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后讀取結(jié)果。

RT-qPCR結(jié)果判斷讀取每個樣品模板及內(nèi)參的Ct值（循環(huán)數(shù)），計算△Ct值后（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），進(jìn)一步計算Foldchange值=2-ΔΔCt。

1.2.3 免疫組織化學(xué) SABC法石蠟切片常規(guī)60℃ 2h烤干后，脫蠟至水；血清封閉液15min；甩干，加一抗30μl；4℃，過夜；沖洗后，加二抗孵育30min；甩干沖洗后，加SABC復(fù)合物30min；甩干沖洗后，DAB顯色10min；終止顯色；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核30s；脫水，透明，封片后，顯微鏡下觀察結(jié)果。ZMYND8一抗?jié)舛葹?∶200；以PBS 作為陰性對照。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷：采用半定量積分法判斷陽性結(jié)果[8]。（1）按染色強(qiáng)度評分：低倍鏡下（×100）隨機(jī)10個視野，無陽性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）按染色面積：低倍鏡下對每張切片隨機(jī)取10個視野，計算陽性區(qū)域面積占癌或癌旁組織總面積百分比；無陽性細(xì)胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。兩項評分相乘，＜2記為陰性，≥2記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有研究數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 26.0及Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行分析和處理。采用配對t檢驗法分析RT-qPCR結(jié)果；采用χ2檢驗分析ZMYND8表達(dá)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；生存分析采用Kaplan-Meier生存分析法；以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織及癌旁組織中ZMYND8 mRNA的表達(dá)

采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測30對新鮮胃癌組織及其癌旁組織中ZMYND8mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：30對組織中，有24對癌旁組織中ZMYND8的mRNA表達(dá)水平高于相應(yīng)的癌組織（圖1A，P＜0.05）；ZMYND8 mRNA在胃癌組織中的Foldchange顯著低于相應(yīng)癌旁組織（圖1B，P＜0.05）。這些結(jié)果均提示，ZMYND8mRNA在癌組織中的表達(dá)量低于對應(yīng)的癌旁組織。

2.2 胃癌組織及癌旁組織中ZMYND8蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)SABC法檢測60對胃癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本中ZMYND8基因在蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ZMYND8主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，成棕黃色顆粒狀陽性表達(dá)（圖2）；在60例胃癌組織中，有13例ZMYND8表達(dá)陽性，47例表達(dá)陰性，陽性率為21.7%；而在60例癌旁組織中，ZMYND8表達(dá)陽性數(shù)為51例，陽性率為85.0%（表1）；差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這些結(jié)果提示ZMYND8蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于其在相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)。

表1 胃癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本中ZMYND8蛋白表達(dá)Tab.1 The expression of ZMYND8 protein in gastric cancer and adjacent paraff in tissues

2.3 胃癌組織中ZMYND8的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性

利用統(tǒng)計學(xué)工具結(jié)合以上免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果，筆者分析了胃癌組織石蠟標(biāo)本中ZMYND8的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果表明：胃癌組織中ZMYND8的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），提示在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及演進(jìn)過程中ZMYND8可能起抑癌基因的作用。見表2：

表2 胃癌組織中ZMYND8的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性Tab.2 The relationship between the expression of ZMYND8 and clinical pathological paraments in gastric cancer tissues

2.4 ZMYND8的表達(dá)與胃癌患者5年生存率的相關(guān)性

采用Kaplan-Meier生存曲線對60例胃癌患者腫瘤石蠟標(biāo)本中ZMYND8的表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明：ZMYND8表達(dá)陽性患者生存率為76.9%（10/13），顯著高于ZMYND8表達(dá)陰性的患者的31.9%（15/47）。ZMYND8表達(dá)陽性患者5年生存率顯著高于陰性表達(dá)者，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；ZMYND8的表達(dá)與患者生存率呈正相關(guān)（P=0.0001）。見圖3：

3 討論

胃癌在我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病的發(fā)病率中排名首位[9]。目前，對于胃癌發(fā)生、發(fā)展的整體認(rèn)識仍存在較多爭議[10-11]。染色體結(jié)構(gòu)的重塑導(dǎo)致DNA損傷是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的重要機(jī)制之一，本文初步探討了組蛋白上溴區(qū)結(jié)合蛋白ZMYND8在胃癌組織中的表達(dá)和意義。

ZMYND8是一種蛋白激酶C結(jié)合蛋白，依靠其N-末端及C-末端的特殊結(jié)構(gòu)域與多種復(fù)合物結(jié)合并相互作用，發(fā)揮多種功能[12]。RCOR2可以與ZMYND8 C-末端MYND結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)分化[13]；組氨酸去甲基化酶KDM5與ZMYND8相互作用后，調(diào)控基因損傷后修復(fù)反應(yīng)[4]。

近期研究表明，ZMYND8在乳腺癌、前列腺癌及卵巢腺癌中發(fā)揮的作用各不相同。Chen等[6]的研究表明，在乳腺癌中乙?；腪MYND8可促進(jìn)乳腺癌的形成和進(jìn)展，通過干擾ZMYND8的表達(dá)可顯著降低癌細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移能力。Mukherjee等[14]的研究表明，同樣在乳腺癌組織中，ZMYND8通過穩(wěn)定上皮細(xì)胞標(biāo)記物，抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生，從而發(fā)揮抑癌基因的作用。Chen等[15]的研究表明，鼻咽癌組織中ZMYND8的低表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，這提示在鼻咽癌組織中ZMYND8可能起了抑癌基因的作用。本文利用免疫組化及RT-qPCR方法檢測胃癌及其癌旁組織中ZMYND8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)癌組織中ZMYND8表達(dá)顯著低于對應(yīng)的癌旁組織，并且ZMYND8蛋白在石蠟包埋癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度及TNM分期呈負(fù)相關(guān)；ZMYND8蛋白陽性表達(dá)的患者5年生存率顯著高于陰性表達(dá)的患者。這些結(jié)果提示ZMYND8可以作為一個胃癌患者的預(yù)后指標(biāo)。值得注意的是，ZMYND8的表達(dá)與胃癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，筆者推測其原因可能為胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的例數(shù)較少。

腫瘤細(xì)胞中染色體結(jié)構(gòu)重塑涉及到多個步驟，其中組氨酸的乙酰化修飾是關(guān)鍵步驟之一。本文初步闡明ZMYND8在胃癌組織中的表達(dá)及意義，但是其抑癌機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。