王治文，劉慧穎，董旭峰，齊 民

(1.大連理工大學 材料科學與工程學院，遼寧 大連，116024;2.大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院,遼寧 大連，116024)

0 引 言

近年來，隨著人類生活方式改變，心血管類疾病的發(fā)病率日益增高。其中，因動脈粥狀硬化和小直徑血管血栓而產(chǎn)生的血管堵塞是較為普遍的心血管疾病[1-5]。在眾多的治療方法中，進行血管移植是較為有效的一種。每年全世界有超過40萬臺搭橋手術[6]，其中大部分與小直徑血管相關。此類小血管的直徑小于6 mm，制備小血管移植物的方法如果直接照搬大直徑血管材料的制備方法，會由于力學性能、順應性不匹配等問題導致二次血栓形成、甚至產(chǎn)生鈣化，導致治療失敗。因此，小直徑血管移植物成為近年來的研究熱點。如何使人造小直徑血移植物在結構和性能上接近天然小血管是研究者們追求的目標。天然小血管為3層結構，其中，內膜由結締組織、彈性纖維和彈性蛋白組成，附著單層內皮細胞(EC)；中膜由一層較厚的膠原蛋白和彈性纖維組成，存在細胞為平滑肌細胞(SMC)；外膜由疏松結締組織組成[7]。為適應不同細胞的生長，天然小血管從內層至外層具有孔徑逐層增大的梯度結構。因此，理想的人造小血管移植物從結構上也應具有與天然血管結構相似的3層孔徑梯度結構。

常見的制備小直徑血管移植物的方法主要為凍融循環(huán)法[8]、靜電紡絲法[9-10]等。凍融循環(huán)法能產(chǎn)生較大的孔徑，但很難產(chǎn)生孔徑的梯度變化，且通常需要配合靜電紡絲共同使用；靜電紡絲法制備的多孔材料具有較高的孔隙率、良好的可調控性、較好的復合性，且電紡纖維可模擬細胞外基質、彈性纖維和膠原纖維[11]，因此靜電紡絲法是較為合適的制備小直徑血管移植物的方法。

已報道的靜電紡絲小直徑血管移植物主要包括兩層梯度和三層梯度兩類。Vaz[12]等通過雙層紡絲，制造了外層為聚乳酸(Polylactic acid，PLA)、內層為聚己內酯(Polycaprolactone，PCL)的血管移植物，但其內層孔徑為15 μm，外層孔徑小于10 μm，與天然小血管孔徑差異較大，導致平滑肌細胞的滲透和內皮細胞的展開出現(xiàn)問題；Liu[13]等人采用單層的靜電紡絲管作為小血管移植物的內層，并通過凍融循環(huán)加入絲素蛋白凝膠作為多孔外層，兩層的疊加產(chǎn)生了明顯的孔徑梯度。其凍融循環(huán)的外層孔徑較傳統(tǒng)靜電紡絲工藝大得多，但孔徑的控制較差，順應性約為2%/mmHg×10-2，與大直徑e-PTFE移植物相近，但低于天然血管(>6%/mmHg×10-2)；Mi[14]等人分別采用靜電紡絲、編織、凍融循環(huán)3種方法制備小血管移植物的內、中、外層，形成從內至外的孔徑遞增梯度，制備了3層小血管移植物，但由于不是一體化制備，層界面會產(chǎn)生應力，易導致脫落，其順應性的不匹配也可能增加植入后二次血栓的風險。

單純采用靜電紡絲的主要問題是過密的纖維沉積形成的孔徑較小，制約了細胞的滲透，影響細胞的成型和再生[15]，因此，需探索靜電紡絲小血管移植物的整體擴孔方法。Azadeh[16]等通過大豆分離蛋白(Soy Isolated Protein，SPI)和聚環(huán)氧乙烷(Polyethylene oxide，PEO)共紡制備血管組織工程支架，再加入無水乙醇浸泡除去其中的PEO纖維，制備出的材料較未浸泡前平均孔徑增大，但是該方法破壞了靜電紡絲致密的互穿網(wǎng)絡，導致整體力學性能下降嚴重；Lee[17]等人對靜電紡絲制備的血管移植物進行超聲處理，大幅提高其孔徑和孔隙率，但較高的超聲能量導致超聲后材料的抗拉強度下降嚴重，由超聲前的(1.66±0.29)MPa，降至(0.26±0.08)MPa。

順應性是指血管移植物響應內部壓力而沿徑向擴張的能力，在植入人體后，小直徑血管移植物更容易由于與原血管的順應性不匹配導致血栓形成和內膜增生[18]。為了避免順應性的不匹配，人造小血管移植物的順應性應盡量與天然小血管相近。這點在之前的報道中關注較少。

針對現(xiàn)有研究中的不足，本論文提出一種改進的靜電紡絲工藝以制備具有孔徑梯度、且各層孔徑滿足應用需求的小血管移植物，其基本思路是在靜電紡絲過程中，通過兩次調控注射泵的推進速度構建三層孔徑梯度，繼而再對其進行超聲處理整體擴孔，最終制備出孔徑較大、且具有孔徑梯度的小血管移植物，并對其微觀結構、基本力學性能、順應性等進行評價。

1 實驗方法

1.1 3LVG的整體制備

配置體積比70∶30的二氯甲烷和DMF溶液(分析純，上海凌峰化學有限公司)，然后加入質量比1∶1的PCL和PLLA(PCL購于深圳光華偉業(yè)有限公司，MV=8×104；PLLA購于山東岱罡生物科技有限公司，MV=1.3×105)，配置質量濃度為10%的PCL/PLLA溶液，磁力攪拌12 h。將配制好的混合溶液注入5 mL自制注射噴頭，噴頭固定于靜電紡絲裝置的滑臺，并與變速微量注射泵相連，針頭前端與電源陽極相連，電源陰極與5 mm外徑、25 cm長的不銹鋼芯軸相接。混合溶液注滿針管，整體裝置接地。

靜電紡絲過程中，控制溫度小于30 ℃，濕度小于40%，紡絲距離為15 cm，噴頭和芯軸之間電壓為20 kV，芯軸旋轉速度為120 r/min。以推進速度1、2、3 mL/h分別作為3LVG的內、中、外層的推進速度。根據(jù)天然血管各層的厚度，考慮人造小血管移植物的順應性，確定其各層的紡絲時間。設計后各層紡絲時間如下：內層紡絲時間83 min，中間層紡絲時間85 min，外層23 min。將制備的樣品取下后，在300 W超聲功率下超聲90 s后，將其放入真空干燥箱12 h以去除殘余溶劑。主要制備流程如圖1所示，得到小直徑血管移植物照片如圖2所示。

圖1 3LVG制備流程圖Fig 1 The fabrication process diagram of 3LVG

圖2 3LVG宏觀形貌Fig 2 The macro morphology of 3LVG

1.2 3LVG的結構表征及性能測試

1.2.1 3LVG的形貌表征

將3LVG的內層、中間層及外層分離后進行真空噴金處理，用SEM(QUANTA 450,USA)以10kV的加速電壓觀察其表面形貌。在各層的SEM照片中分別選取隨機10個位置，共選取至少80根纖維及其所圍成的孔，通過Image J進行纖維直徑和孔面積的分析，采用GAUSS函數(shù)擬合其分布。

1.2.2 3LVG的孔隙率測定

采用液體置換法測試3LVG孔隙率，實驗樣本數(shù)為5個。

(1)

式中，WS為3LVG試樣的質量；W1為裝滿無水乙醇的比重瓶質量；W2為3LVG完全浸入比重瓶時的質量；W3為取出3LVG后比重瓶的質量；ρ為孔隙率。

1.2.3 3LVG的基本力學性能測試

(1)軸向力學表征

軸向拉伸測試如圖3(a)所示，根據(jù)ISO 7198—2016標準制備3LVG拉伸樣，測試軸向拉伸強度。在測試之前，所有試樣都在真空干燥箱中干燥24 h。通過SEM圖和Image J 測量其3個位置的厚度并取最小值。以加載速率5 mm/min拉伸，計算軸向抗拉強度和斷裂伸長率。

(2)徑向力學表征

對3LVG試樣進行徑向拉伸強度測試，其中自制U型夾具見圖3(b)。將支架制備成5 mm寬的環(huán)，在測試之前，所有試樣都在真空干燥箱中干燥24 h。通過SEM圖和Image J 測量三個位置的厚度并取最小值，采用自制的U型夾具配合拉伸機夾持；加載速率5 mm/min。通過公式(2)計算徑向抗拉強度和斷裂伸長率。

(2)

式中，F(xiàn)1為拉伸應力；t為試樣寬度；h為試樣厚度；σ1為徑向抗拉強度(MPa)。

(3)爆破壓力

采用之前得到的3LVG徑向抗拉強度，以公式(3)計算爆破壓力[19]。

(3)

式中，R為小血管移植物的初始內徑；P爆破為爆破壓力(mmHg)。

(4)縫合保持力

縫合保持力的測試見圖3(c)。將3LVG裁剪成長度為30 mm，寬度為15 mm的矩形樣品，將樣品的一端夾在小型拉伸機夾具上，在距支架樣品邊緣3 mm的位置采用5-0 聚丙烯縫合線將其縫合至有孔的硬板上，硬板另一端由拉伸機下端夾持，以加載速率5 mm/min進行拉伸，測量拉伸過程中試樣撕裂時的力，其數(shù)值對應3LVG的縫合保持力，更換樣品，重復實驗3次。

圖3 3LVG力學性能測試Fig 3 Themechanical properties tests of 3LVG

1.2.4 3LVG的順應性測試

自制的順應性設備由兩部分組成，其中位移傳感器用于測量實時的外徑變化；加壓氣泵和壓力表用于給3LVG均勻加壓和實時測壓。順應性測試系統(tǒng)見圖3d。測試時，先將外徑為5 mm的橡膠管穿入3LVG中保證其不漏氣(橡膠管的順應性遠高于樣品，對測量影響較小)，將橡膠管一端插入氣泵，另一端打結封死，再將位移傳感器放置在3LVG兩端。測試過程中，氣泵加壓范圍為10.64～15.96 kPa，分別獲得對應收縮壓下的外徑值，再通過公式(4)、(5)計算不同壓力區(qū)間上的內徑及順應性值[20]，每個壓力值下重復實驗3次。

(4)

式中，idp為3LVG在不同壓力下測量出的內徑；odp為3LVG在不同壓力下測量出的外徑，A為支架的橫截面積。

(5)

式中，P舒張為舒張壓；P收縮為收縮壓，順應性單位為%/mmHg×10-2。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

本文的比較性統(tǒng)計數(shù)據(jù)都通過SPSS軟件進行了單因素方差分析，其中p<0.05為顯著。全部數(shù)據(jù)除特殊提及外均以均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 3LVG的微觀形貌

圖4為3LVG各層的SEM圖，由圖可見，3LVG各層都未出現(xiàn)串珠和纖維大范圍的團聚，纖維出現(xiàn)一定程度的彎曲；外層較內層孔的數(shù)量有所減少、孔徑明顯增大；而中間層與內層相比，有更多的較大孔出現(xiàn)，總體孔徑增加不明顯。3LVG各層的纖維直徑、孔面積分布由Gauss函數(shù)擬合，分別如圖5和6所示。圖5(a)表明：內層纖維直徑大部分集中于0.2 ～0.6 μm區(qū)間內，且不存在大于1.2μm的纖維。圖5(b)、(c)表明：3LVG中間層和外層的纖維直徑大部分集中在0.6～1.0 μm的區(qū)間內，其中外層0.6 ～1.0 μm范圍內的纖維所占比例較中間層更高；圖5(d)為各層的平均纖維直徑柱狀圖，其中，外層纖維直徑為(0.79±0.21)μm，低于中間層直徑的(0.91±0.31)μm，高于內層的(0.45±0.16)μm；各層的纖維直徑均小于4 μm，理論上不影響細胞的正常滲透和增殖[21]。

圖4 3LVG各層SEM圖Fig 4 SEM images of 3LVG

圖5 3LVG各層纖維直徑分布及對比Fig 5 Fiber diameter distribution of each layer of 3LVG

圖6(a～c)中，3LVG內層孔面積主要分布于10～30 μm2；中間層孔面積大多分布于30～100 μm2區(qū)間內；外層孔面積大部分分布于100～250 μm2，除外層存在300 μm2以上的較大孔外，內層和中間層的孔徑均小于200 μm2。內層、中間層、外層孔面積由內至外依次增加。圖6d為各層的孔平均面積柱狀圖，并對孔面積擬合了孔徑，其中內層孔徑為(5.60±3.20) μm、中間層孔徑為(9.82±6.82) μm、外層孔徑為(14.47±9.51) μm，孔徑由內至外逐漸增大，表明3LVG中成功建立了遞增的孔徑梯度。血管內層適宜內皮細胞增殖的孔徑范圍為1～10 μm，3LVG的內層，其孔徑均值大于5 μm，在適宜孔徑范圍內[15,22]；血管內適宜平滑肌細胞滲透的孔徑范圍為10～50 μm，3LVG中層和外層孔徑都在范圍內，滿足平滑肌細胞的增殖滲透要求[15,23]。

圖6 3LVG各層孔面積分布及對比Fig 6 Porearea distribution of each layer of 3LVG

2.2 3LVG的孔隙率

3LVG各層的孔隙率測試表明，內層孔隙率為87.49%±3.39%，與中間層的87.16%±8.20%相差不多，略小于外層孔隙率(90.01%±6%)；3LVG整體孔隙率為88.4%±2.80%。3LVG內、中、外層及整體孔隙率均大于85%，這種高孔隙率適合細胞的粘附增殖。

2.3 3LVG的基本力學性能

圖7為3LVG在兩種拉伸模式下的應力應變曲線。3LVG的軸向抗拉強度為(2.66±0.26)MPa，徑向抗拉強度為(2.79±0.21)MPa，兩者相差不大，這種現(xiàn)象與靜電紡纖維在制備時的各向同性相吻合。3LVG的軸向斷裂延伸率為18.98%±4.74%，低于徑向的25.21%±0.70%，這種軸向與徑向斷裂延伸率的差異，可能與拉伸模式的改變有關。表1列出3LVG基本力學性能與幾類天然血管的數(shù)據(jù)，由表可以看出，3LVG的軸/徑向拉伸強度與人冠狀動脈比較相近，這種力學性能的匹配有助于3LVG在植入后降低二次血栓的風險。

圖7 3LVG的軸向/徑向應力應變圖Fig 7 Stress-strain curves of 3LVG in the axial/circular directions

由表1還可看出，3LVG的爆破壓力為(176.36±13.26)kPa，略低于人隱靜脈的(223.44±40.83)kPa，但高于正常人體收縮血壓3倍以上，因此能夠在正常人體中正常發(fā)揮作用。3LVG的縫合保持力為(2.07±0.38)N，而人冠狀動脈的縫合保持力為1.95 N、人隱靜脈的縫合保持力為(1.76±0.45)N。3LVG的縫合保持力要高于這兩種血管，證明3LVG有著更好的縫合保持性能[24]。

2.4 3LVG的順應性

根據(jù)表1，在人體正常血壓范圍內(10.64～15.96 kPa)，3LVG順應性為0.66%±0.01%/0.133 kPa×10-2，與人冠狀動脈順應性值[25]相似，高于人隱靜脈，表明3LVG與人冠狀動脈的順應性相匹配。

表1 3LVG和天然血管的基本力學性能及順應性對比Table 1 Mechanical properties of 3LVG and typical native blood vessels

3 結 論

(1)通過變速率逐層紡絲并結合超聲擴孔工藝，可制備出具有三層孔徑梯度的小直徑血管移植物(3LVG)。

(2)3LVG的內層孔徑為(5.60±3.20)μm、中間層孔徑為(9.82±6.82)μm、外層孔徑為(14.47±9.51)μm，形成了由內至外遞增的孔徑梯度，其各層孔徑在天然血管對應層細胞適宜增殖的孔徑范圍內。各層纖維直徑都低于4μm，可以供細胞正常粘附增殖。3LVG孔隙率為88.4%±2.80%，可以滿足細胞培養(yǎng)。

(3)3LVG軸向抗拉強度為(2.66±0.26)MPa，徑向抗拉強度為(2.79±0.21)MPa，均接近人冠狀動脈的軸徑向抗拉強度；3LVG爆破壓力為(176.36±13.26)kPa，低于人隱靜脈的爆破壓力，但高于人體正常收縮壓的3倍以上，可以在人體體內正常使用；3LVG的縫合保持力為(2.07±0.38) N，強于人乳腺血管和人隱靜脈。

(4)人體血壓范圍下3LVG的順應性為6.6±0.01%/0.133kPa×10-2，與人動脈相近，順應性匹配較好。