王啟源， 姬文蘭， 虞秀鋒

（陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)四科，陜西 西安 710100）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種人畜共患傳染病。MTB是一種典型的胞內(nèi)致病菌，可通過(guò)多種不同機(jī)制逃逸機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷及清除，從而在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖，并長(zhǎng)期在機(jī)體內(nèi)存活。巨噬細(xì)胞是宿主抵御MTB感染的第一道防線，也是控制其復(fù)制和繁殖的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[1]。MTB侵入機(jī)體感染宿主后誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，從而激活巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫機(jī)制，抑制其在體內(nèi)擴(kuò)散，增強(qiáng)機(jī)體的免疫殺傷能力[2-3]。此外，細(xì)胞凋亡可作為細(xì)胞內(nèi)MTB的防御機(jī)制，降低其生存能力，研究巨噬細(xì)胞的凋亡可進(jìn)一步明確MTB的致病機(jī)制，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

嗅素蛋白4（olfactomedin，OLFM4），是嗅覺(jué)介導(dǎo)素蛋白家族成員之一，編碼510個(gè)氨基酸，屬于分泌型糖蛋白，廣泛分布于骨髓、小腸、結(jié)腸和胰腺等器官。有研究報(bào)道，OLFM4通過(guò)多種機(jī)制參與細(xì)胞凋亡、增殖和分化等進(jìn)程，在抗細(xì)菌感染先天免疫、胃腸道炎癥及癌癥中發(fā)揮著重要作用[4]，可能成為這些疾病的潛在治療靶點(diǎn)。有研究結(jié)果表明，OLFM4在幽門螺桿菌感染患者中上調(diào)，且通過(guò)調(diào)控NF-κB通路參與宿主對(duì)幽門螺桿菌感染的先天免疫[5]。此外，OLFM4缺失的小鼠通過(guò)上調(diào)組織蛋白酶C和下游蛋白酶活性增加了嗜中性粒細(xì)胞對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的殺傷[6]。在小鼠中性粒細(xì)胞中，OLFM4缺失抑制H2O2誘導(dǎo)的還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADPH）氧化酶活性及凋亡，表明OLFM4可作為治療炎性疾病的潛在靶點(diǎn)[7]。然而OLFM4在卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)采用BCG菌株感染巨噬細(xì)胞RAW264.7建立穩(wěn)定的MTB感染巨噬細(xì)胞模型，探討OLFM4對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡及其對(duì)BCG在巨噬細(xì)胞中存活的影響，以期闡明其對(duì)巨噬細(xì)胞抗BCG感染的免疫調(diào)控機(jī)制，為治療TB尋找新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海市生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所），BCG菌株（上海生物制品研究所有限公司），DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），SYBR Green試劑盒和Cell Death Detection ELISA Kit（德國(guó)Roche公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），硝酸纖維素膜（polyvinylidene fluoride membranes，PVDF）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（美國(guó)Millipore公司），OLFM4、Bax、Bcl-2和β-actin抗體（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素以及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。

1.2.2 BCG感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 當(dāng)RAW 264.7細(xì)胞穩(wěn)定后長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，按照感染復(fù)數(shù)為10∶1接種BCG菌懸液，搖勻后置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。4 h后棄上清，以預(yù)溫的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次，去除未感染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，更換新鮮培養(yǎng)液，作為細(xì)胞感染的0 h。分別于BCG感染巨噬細(xì)胞0、12、24、48 h時(shí)檢測(cè)各組OLFM4的表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將巨噬細(xì)胞RAW264.7（1×105個(gè)/孔）接種于12孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%，采用Lipofectamine 2000試劑將si-OLFM4及陰性對(duì)照（si-NC）轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24 h后，采用實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerasechain reaction，RT-PCR）及免疫印跡法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)核酸濃度。將細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green試劑盒通過(guò)ABI Prism 7900實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）檢測(cè)目標(biāo)mRNA的表達(dá)水平。以β-actin為內(nèi)參照，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。50 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis，SDSPAGE）電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次；加入辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，拍照；用ImageJ分析各個(gè)條帶的吸光度值。計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值的比值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將RAW264.7細(xì)胞5×105個(gè)/mL接種于6孔板培養(yǎng)皿中，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡。

1.2.7 BCG生存力檢測(cè) 采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)BCG生存率，細(xì)菌感染4 h后，用不含血清的DMEM洗滌，除去未被吞噬的細(xì)菌。在培養(yǎng)板中再加入完全DMEM培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)。分別于感染后24和48 h棄去培養(yǎng)液，每孔加入500 μL 0.5%Triton X-100裂解細(xì)胞，待細(xì)胞全部裂解后加入500 μL完全培養(yǎng)液終止裂解。震蕩混勻5 min，將稀釋后的裂解物分3份接種于含油酸白蛋白葡萄糖過(guò)氧化氫酶（oleicalbumindextrosecatalase，OADC）的7H11瓊脂平板上，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)程序重復(fù)3次計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。數(shù)據(jù)以x±s表示，2個(gè)組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OLFM4在BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá)

RT-PCR和免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，OLFM4在BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中明顯上調(diào)，并呈時(shí)間依賴性；RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC和si-OLFM4結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-OLFM4后，OLFM4mRNA和蛋白表達(dá)的水平顯著下降。見(jiàn)圖1。

圖1 OLFM4在BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá)

2.2 OLFM4對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的影響

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，BCG感染的RAW264.7細(xì)胞凋亡率明顯升高，而OLFM4沉默顯著降低BCG誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，BCG感染的巨噬細(xì)胞RAW264.7中，抑凋亡蛋白Bcl-2顯著下調(diào)，同時(shí)促凋亡蛋白Bax明顯上調(diào)，而沉默OLFM4顯著逆轉(zhuǎn)BCG介導(dǎo)的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 OLFM4沉默抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

2.3 OLFM4對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7中BCG存活率的影響

平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，OLFM4沉默后RAW264.7感染24和48 h的BCG的存活率明顯升高，提示沉默OLFM4能夠抑制宿主對(duì)分枝桿菌的防御作用。見(jiàn)圖3。

2.4 沉默OLFM4阻斷BCG介導(dǎo)的TLR2/NF-κB信號(hào)通路

為探討OLFM4對(duì)BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，我們檢測(cè)了OLFM4對(duì)TLR2/NF-κB信號(hào)的影響，結(jié)果顯示，OLFM4抑制BCG誘導(dǎo)的p-p65和TLR2的表達(dá)水平下調(diào)，而總p65表達(dá)水平不變，提示OLFM4沉默可抑制BCG介導(dǎo)的TLR2/NF-κB信號(hào)通路。見(jiàn)圖4。

圖3 OLFM4沉默促進(jìn)胞內(nèi)BCG存活

圖4 沉默OLFM4抑制BCG誘導(dǎo)的TLR2/NF-κB通路

3 討論

MTB存在于被感染宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)，可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡，而這種調(diào)控與其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存密切相關(guān)，影響TB的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是殺死MTB的重要途徑[8-9]，OLFM4可調(diào)節(jié)宿主對(duì)各種細(xì)菌感染的先天免疫[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，OLFM4在BCG感染的RAW264.7細(xì)胞中明顯升高，BCG感染引發(fā)RAW264.7細(xì)胞凋亡，而沉默OLFM4能夠抑制BCG誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，并下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，從而抑制BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。

巨噬細(xì)胞作為MTB的主要宿主細(xì)胞和靶細(xì)胞，二者之間的相互作用較為復(fù)雜。細(xì)胞凋亡是巨噬細(xì)胞殺死MTB的必要條件，而強(qiáng)毒性的MTB可抑制細(xì)胞凋亡而誘發(fā)壞死，促進(jìn)細(xì)菌逃逸進(jìn)入周圍組織開始新的感染周期，最終導(dǎo)致MTB傳播。MTB主要在巨噬細(xì)胞等宿主免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖。本研究結(jié)果顯示，OLFM4沉默能夠增強(qiáng)MTB的存活率，促進(jìn)MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)。OLFM4沉默在BCG感染機(jī)體的過(guò)程中通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞凋亡參與宿主與BCG的相互作用，這為TB的防治提供了一定的理論基礎(chǔ)，可以幫助開辟一條新的治療途徑。

在MTB感染過(guò)程中，巨噬細(xì)胞中的多個(gè)分子及其相關(guān)信號(hào)通路參與了巨噬細(xì)胞凋亡的調(diào)控，對(duì)凋亡相關(guān)機(jī)制的研究將有助于闡明TB的發(fā)病機(jī)制，并為其防治提供新的思路。NF-κB在先天性免疫系統(tǒng)及適應(yīng)性免疫應(yīng)答中具有重要作用，而且MTB感染能夠激活NF-κB信號(hào)通路[10-11]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是先天免疫的關(guān)鍵效應(yīng)分子，能夠與一些病原體特異性配體結(jié)合，在宿主細(xì)胞中啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并激活NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞因子及病原體的適應(yīng)性免疫反應(yīng)[12]。TLR2在MTB感染的典型免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用[13]。有研究報(bào)道，NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄能夠被分枝桿菌BCG或是巨噬細(xì)胞中TLR2的分枝桿菌配體調(diào)節(jié)從而產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)OLFM4能夠降低p-p65和TLR2的表達(dá)，從而抑制TLR2/NF-κB通路的活性，提示TLR2/NF-κB通路參與了OLFM4調(diào)節(jié)致病性細(xì)菌BCG感染的免疫應(yīng)答進(jìn)程。

OLFM4沉默可抑制BCG感染的巨噬細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)BCG存活率，其機(jī)制可能是通過(guò)TLR2/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，后續(xù)我們擬構(gòu)建TB感染動(dòng)物模型，進(jìn)一步從體內(nèi)證實(shí)OLFM4在機(jī)體抗BCG感染過(guò)程中的免疫調(diào)控作用與機(jī)制，為進(jìn)一步研究BCG感染的致病機(jī)制提供新的思路，并為研制TB治療藥物提供新靶點(diǎn)。