袁世洋， 劉 川， 歐陽曉春， 謝軍平， 賀榮芝， 李里香， 鄒葉青

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，福建 南平 353000；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第908醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 南昌 330009；4.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，江西 南昌 330006）

最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌占癌癥發(fā)生率和死亡率的首位，分別為11.6%和18.4%[1]。肺癌按組織學(xué)分型可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中NSCLC占原發(fā)型肺癌的80%～85%[2]。近年來，針對(duì)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因分子靶向治療的快速發(fā)展雖然給具有EGFR敏感突變的NSCLC患者帶來了福音，但是腫瘤治療的耐受問題卻不可避免。目前研究結(jié)果顯示，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）獲得性耐藥機(jī)制中約60%由EGFRT790M突變引起[3]，而奧希替尼能使這類患者明顯獲益[4]。由此可見，在NSCLC患者接受EGFR-TKI靶向治療的過程中，監(jiān)管EGFRT790M突變對(duì)及時(shí)應(yīng)用奧希替尼治療是非常必要的?！耙后w活檢”技術(shù)近年來倍受推崇，其中循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為“液體活檢”技術(shù)的“三駕馬車”之一，更受研究者關(guān)注。有研究結(jié)果顯示，晚期NSCLC患者血漿ctDNA中存在EGFRT790M突變，并能受益于奧希替尼治療[5]。但血漿ctDNA的分子片段小、豐度低等特性給基因檢測(cè)在臨床中的應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)[6]。本研究所采用的3D數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是在數(shù)字PCR的基礎(chǔ)上，將混有樣品和探針的PCR反應(yīng)體系均勻分散至1張含有2萬個(gè)ctDNA微孔的芯片上，形成2萬個(gè)相互獨(dú)立的微反應(yīng)體系，每個(gè)微孔進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，根據(jù)泊松分布的數(shù)學(xué)模型計(jì)算目標(biāo)片段拷貝數(shù)。本研究以擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）作為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)3D數(shù)字PCR檢測(cè)血漿EGFRT790M基因突變的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集2017年10月—2018年8月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室被檢測(cè)為初代EGFR-TKI耐藥的70例NSCLC患者作血液標(biāo)本及臨床資料，編號(hào)后由2位實(shí)驗(yàn)人員分別采用ARMS和3D數(shù)字PCR對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行EGFRT790M基因突變檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不一致的患者，及時(shí)反饋給臨床醫(yī)生，盡可能獲取患者腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.2 儀器與試劑

7500 Real Time PCR Systerm、Proflex 2×Flat PCR System、3D數(shù)字PCR芯片閱讀儀和3D數(shù)字PCR芯片裝載儀購自美國Life Technologies公司；Qubit 3.0熒光計(jì)、ST16R臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式低速離心機(jī)等購自美國Thermo Fisher公司。人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒、石蠟組織切片DNA提取試劑盒購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司；人EGFR基因T790M突變檢測(cè)試劑盒、磁珠法核酸提取血漿游離DNA提取試劑盒購自天津諾禾致源科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血漿標(biāo)本ctDNA提取 使用2支乙二胺四乙酸抗凝采血管，采集不少于15 mL全血，1 600×g離心10 min取上清，將取得的上清液于4 ℃、16 000×g離心10 min。把離心后的血漿分裝到15 mL離心管中，加入20%十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和蛋白酶K，混勻后于60 ℃孵育20 min。準(zhǔn)備新的15 mL離心管，依次加入ctDNA結(jié)合液及ctDNA捕獲磁珠，將孵育后的血漿置于冰上5 min，再將血漿加入剛準(zhǔn)備好的離心管中，充分混勻。將離心管置于15 mL磁力架上5 min，直至磁珠完全被磁力吸附到同一側(cè)，小心移出上清液，加入ctDNA漂洗液漂洗2次，80%乙醇漂洗2次，最后用50 μL ctDNA洗脫液洗脫，磁力架吸附后吸取上清，即為ctDNA。使用Qubit 3.0熒光計(jì)測(cè)定所提取ctDNA的濃度，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 腫瘤組織標(biāo)本DNA提取 切取5～8片5 μm厚度的腫瘤組織放入1.5 mL離心管內(nèi)，經(jīng)脫蠟、脫苯處理后，使用石蠟組織切片DNA提取試劑盒提取DNA。使用Qubit 3.0熒光計(jì)測(cè)定所提取的DNA濃度，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 檢測(cè)血漿EGFRT790M突變 （1）ARMSEGFR突變檢測(cè)：使用人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按說明書進(jìn)行；（2）3D數(shù)字PCR血漿EGFRT790M突變檢測(cè)：樣本稀釋后取30 ng ctDNA原液，加入去離子水至體積為6.75 μL，加入T790M-M1 7.5 μL、T790M-M2 0.75 μL，使終體積為15 μL，微離心后充分混勻，用3D數(shù)字PCR芯片裝載儀上樣14.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：96 ℃ 10 min；62 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；10 ℃保持。用3D數(shù)字PCR芯片閱讀儀讀取芯片，并采用分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.4 結(jié)果判讀 ARMS檢測(cè)結(jié)果的判讀根據(jù)說明書進(jìn)行（圖1）。3D數(shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果的判讀依據(jù)配套軟件進(jìn)行自動(dòng)分析，即自動(dòng)分析每個(gè)樣本每個(gè)微滴的FAM和VIC的熒光信號(hào)，根據(jù)陽性微滴的比例自動(dòng)獲得PCR反應(yīng)體系中起始模板DNA拷貝數(shù)濃度，并給出突變百分比，當(dāng)突變百分比≥0.1時(shí)顯示陽性（圖2）。

圖1 ARMS檢測(cè)血漿EGFR T790M突變

圖2 3D數(shù)字PCR檢測(cè)血漿EGFR T790M突變

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Kappa一致性檢驗(yàn)和配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較ARMS和3D數(shù)字PCR檢測(cè)患者血漿EGFRT790M結(jié)果的一致性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床特征

70例NSCLC患者中，男28例、女42例，年齡43～83歲，中位年齡62歲。所有患者均為晚期NSCLC，其中61（87.1%）例為腺癌。所有患者均接受EGFR-TKI靶向治療，其中有58（82.9%）例選擇了吉非替尼治療。既往EGFR突變狀態(tài)：41（58.6%）例為19-Del，27（38.6%）例為L858R突變。使用EGFRTKI靶向治療后（檢測(cè)時(shí)已明確腫瘤進(jìn)展），EGFRT790M總突變率為48.6%，其中男性患者的EGFRT790M突變率為53.6%，女性患者為45.2%。見表1。

表1 患者一般臨床特征 例（%）

2.2 3D數(shù)字PCR和ARMS檢測(cè)血漿EGFR T790M基因突變結(jié)果比較

為了解3D數(shù)字PCR檢測(cè)NSCLC患者血漿EGFRT790M突變的臨床價(jià)值，我們把同一份血漿標(biāo)本提取的ctDNA平均分為3份：1份用3D數(shù)字PCR檢測(cè)；1份采用ARMS檢測(cè)，并且將所得結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)；另1份保存在-80℃冰箱用于復(fù)檢。對(duì)2種方法檢測(cè)結(jié)果不同的標(biāo)本，及時(shí)反饋給臨床醫(yī)生，獲取腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。70份血漿標(biāo)本中，ARMS檢出T790M突變30（42.9%）例，3D數(shù)字PCR檢出34（48.6%）例（表2）。采用Kappa一致性檢驗(yàn)比較這2種方法檢測(cè)患者血漿EGFRT790M突變結(jié)果的一致性，結(jié)果顯示Kappa值為0.885（P＜0.001），表示2種方法診斷結(jié)果一致性良好。

表2 3D數(shù)字PCR和ARMS檢測(cè)NSCLC患者血漿EGFR T790M突變的比較 例

有4例血液標(biāo)本2種方法的檢測(cè)結(jié)果不同，且ARMS檢測(cè)結(jié)果均為EGFRT790M野生型。這4例患者中有3例進(jìn)行了再次組織活檢檢測(cè)，1例拒絕。復(fù)檢結(jié)果顯示，ARMS檢測(cè)這3例均為EGFRT790M突變。這些結(jié)果表明，3D數(shù)字PCR和ARMS一樣可用于檢測(cè)NSCLC患者血漿EGFRT790M突變，并且3D數(shù)字PCR還可以檢測(cè)出ARMS所漏檢的EGFRT790M突變患者。

3 討論

EGFR基因是NSCLC的一個(gè)非常重要的驅(qū)動(dòng)基因，基于EGFR突變機(jī)制及藥物研究的快速發(fā)展，NSCLC的治療方式發(fā)生了巨大轉(zhuǎn)變。EGFR突變的NSCLC患者初代EGFR-TKI療效顯著，但仍在9～13月內(nèi)不可避免地產(chǎn)生耐藥[7]。目前已有研究報(bào)道了初代EGFR-TKI的眾多獲得性耐藥機(jī)制，如EGFRT790M突變、MET基因擴(kuò)增、ERBB2基因擴(kuò)增、肝細(xì)胞生長因子過表達(dá)、PTEN基因失活等[8-9]，其中約有60%的EGFR-TKI的獲得性耐藥是由EGFRT790M突變引起的[3]。

目前，一般通過定期的胸部電子計(jì)算機(jī)斷層掃描等影像學(xué)復(fù)查評(píng)價(jià)腫瘤治療的有效性，但有研究結(jié)果顯示，在疾病進(jìn)展早期就可以在外周血中檢測(cè)到EGFRT790M突變[10]。因此，在EGFR-TKI治療過程中通過檢測(cè)血液EGFRT790M突變對(duì)早期發(fā)現(xiàn)因EGFRT790M突變引起的耐藥性也有著積極的臨床意義。另一方面，血液標(biāo)本比腫瘤組織樣本采集更簡(jiǎn)便，且無創(chuàng)，患者的依從性更佳。

目前，已有多種半定量和定量基因分析平臺(tái)被開發(fā)用于血漿EGFR基因分型檢測(cè)，包括AMRS[11]、微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[12]以及下一代測(cè)序（next-generation gene sequencing，NGS）[13]等。ZHANG等[14]從311個(gè)研究中篩選出11個(gè)血漿EGFR基因檢測(cè)法納入系統(tǒng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR檢測(cè)ctDNAEGFRT790M突變的敏感性和特異性分別為70.1%和86.9%。THRESS等[15]使用4種方法（包括2種非數(shù)字法和2種數(shù)字法）檢測(cè)血漿ctDNAEGFR突變，結(jié)果表明數(shù)字方法檢測(cè)EGFRT790M突變具有更好的敏感性。

采用Kappa一致性檢驗(yàn)比較ARMS和3D數(shù)字PCR檢測(cè)患者血漿EGFRT790M突變結(jié)果的一致性，發(fā)現(xiàn)2種方法的一致性良好。此外，本研究對(duì)ARMS檢測(cè)EGFRT790M為野生型而3D數(shù)字PCR檢測(cè)EGFRT790M突變的4例患者中的3例再次進(jìn)行腫瘤組織標(biāo)本檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)此3例均為EGFRT790M突變表明3D數(shù)字PCR在具有較高敏感性的同時(shí)，也顯示出了較好的特異性，可以檢測(cè)出ARMS所漏檢的EGFRT790M突變患者。這一觀點(diǎn)與FENG等[16]的研究結(jié)果一致。

本研究尚存在一些不足之處：首先，我們并未對(duì)所有患者的腫瘤組織樣本進(jìn)行EGFRT790M突變檢測(cè)，以更好地對(duì)ARMS和3D數(shù)字PCR檢測(cè)血漿EGFRT790M突變的敏感性和特異性進(jìn)行比較；其次，納入的樣本量相對(duì)較小，仍需要更大樣本量的臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。總而言之，本研究認(rèn)為3D數(shù)字PCR是一種高敏感性和特異性的新方法，適用于檢測(cè)NSCLC患者血漿EGFRT790M基因突變。