萬文婷， 于 波， 弓孟春， 史文釗， 郭 昊， 楊 杰

（1.神州數(shù)碼醫(yī)療科技股份有限公司科學事務部，北京 100080；2.南華大學附屬湘潭醫(yī)院泌尿外科，湖南 湘潭 411101）

黑色素瘤是由黑色素細胞過度增殖引起的一種極具侵襲性的皮膚腫瘤，多發(fā)于皮膚黏膜及肢端，雖然其發(fā)病率僅占皮膚腫瘤的10%，但與80%的皮膚腫瘤死亡事件相關[1]。2018年的全球癌癥報告表明，黑色素瘤新增病例為287 723例，死亡人數(shù)達60 712人[2]。在我國，黑色素瘤Ⅳ期的患者5年生存率＜5%[3]。在黑色素瘤初期，首選手術切除，而對于中晚期患者，傳統(tǒng)的放化療等手段起效甚微。針對不能進行手術切除或已經轉移并出現(xiàn)BRAFV600E突變的黑色素瘤患者，2011年美國食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準維莫非尼作為靶向藥物對黑色素瘤患者進行治療，黑色素瘤的治療跨入靶向治療時代。基因檢測可以指導靶向治療方案的制定監(jiān)測疾病進展。

組織活檢是臨床基因檢測的金標準，然而組織活檢存在許多不足之處，如穿刺過程風險高、解剖位置不佳、價格高、操作復雜、腫瘤組織自身的異質性等。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測是近年來被用于檢測人體內基因突變的新興方法。ctDNA是腫瘤細胞DNA脫落或凋亡后進入血液循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段，是一種特殊的腫瘤標志物[4]，其具有非侵入性、易獲取、可連續(xù)取樣、可克服腫瘤異質性等優(yōu)點，可作為組織活檢的補充用于臨床的診斷和疾病監(jiān)測。PINZANI等[5]指出，在黑色素瘤患者中，與腫瘤組織的檢測結果相比，ctDNA檢測的敏感性為72%，特異性為89%，與腫瘤病理檢測結果一致性為80%。TANG等[6]的報道顯示，在58名黑色素瘤患者中，ctDNA與腫瘤組織的檢測結果一致性為70%。HASELMANN等[7]在一項對187名黑色素瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)，乳滴數(shù)字聚合酶鏈反應（bead，emulsion，amplification and magnetic，BEAMing）可以提高ctDNA的檢測敏感性（86%）和特異性（93%），并且一致性高達90%，提示ctDNA具有較好的診斷價值。由于ctDNA檢測的準確率受到檢測儀器、樣本來源、疾病分期等多種因素的影響，目前對于其臨床應用價值仍存在爭議。

本研究通過定量Meta分析，評估配對的黑色素瘤組織樣本和外周血中ctDNA基因突變檢測結果的一致性，為臨床應用提供循證依據。

1 材料和方法

1.1 檢索策略

通過Medline、Cochrane Library、Excerpta Medica Database（Embase）、中國知網及維普數(shù)據庫進行文獻檢索，檢索數(shù)據收集時間為從建庫至2019年1月。語言限定為中文和英文。中文檢索詞為“黑色素瘤”、“ctDNA”、“循環(huán)游離DNA”；英文檢索詞為“Melanoma”、“circulating tumor DNA”、“circulating cellfree DNA”，并且通過人工檢索進行補充。

1.2 文獻納入標準和排除標準

文獻納入標準：（1）入組患者均為確診的黑色素瘤患者；（2）可獲得血液中ctDNA的基因突變檢測結果；（3）具有配對的病理組織的基因突變檢測結果；（4）文獻中有足夠的數(shù)據可以直接或間接計算得到假陽性（false positivity，F(xiàn)P）、假陰性（false negativity，F(xiàn)N）、真陰性（true negativity，TN）和真陽性（true positivity，TP）的值。文獻排除標準：（1）綜述、案例報道、評論等文獻；（2）沒有檢測組織或者沒有檢測血液中的基因突變，或者血液與組織沒有一一配對；（3）數(shù)據不全；（4）非人體研究；（5）＜10人的研究。

1.3 資料提取與質量評價

由2名科研人員分別從事篩選文獻、質量評價及數(shù)據提取的工作，后期進行匯總和核對。如果遇到意見不一致，提交至第3位研究人員決定。數(shù)據提取信息如下：第一作者姓名、文獻發(fā)表年份、國家、TNM分期、是否轉移、樣本量、組織樣本的類型、血液樣本類型、血液中基因突變的檢測方法及突變基因位點，結果指標包括TP、FP、FN、TN的值和檢測敏感性、特異性、結果的一致性。用診斷準確性研究質量評價標準-2（QUADAS-2）量表對入組文獻進行質量評估。QUADAS-2量表主要由4個部分組成：病例的選擇、待評價試驗、金標準、病例流程和進展情況。測評所有組成部分的偏移風險，同時測評前3部分臨床適用性。基于每部分納入的相關標志性問題作出“是”、“否”或“不確定”的判斷，可對應將偏移風險等級確定為“低”、“高”或“不確定”。在偏移風險判斷上納入與偏移潛在性有關的標志性問題，旨在幫助評價者判斷偏移風險，但臨床適用性的判斷未納入標志性問題[8]。

1.4 統(tǒng)計學方法

通過Spearman相關系數(shù)檢查有無閾值效應引起的異質性。非閾值效應的異質性以I2和Q檢驗為指標，當I2＞50%或P＜0.05時，表明異質性顯著，選用隨機效應模型計算；當I2＜50%或P＞0.05時，表明異質性不顯著，則選用固定效應模型計算。通過Stata 15.0軟件，基于FP、FN、TN和TP的值，計算敏感性、特異性、綜合受試者工作曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）、合并陽性似然比（positive likelihood ratio，PLR）、合并陰性似然比（negative likelihood ratio，NLR）、合并診斷優(yōu)勢比（diagnostic odds ratio，DOR）以及相應的95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。使用Deeks'漏斗圖分析是否存在發(fā)表偏移，當P＜0.10時表明存在發(fā)表偏移。

2 結果

2.1 文獻檢索

基于5個數(shù)據庫的檢索結果，共收集到英文文獻408篇，中文文獻36篇，剔除重復文獻40篇，經過閱讀文獻標題及摘要內容后初篩排除文獻337篇。后續(xù)通過仔細閱讀全文進行進一步篩查，共計排除文獻57篇，其中包括沒有組織檢測結果的文獻20篇，結局數(shù)據不全的文獻21篇，研究對象＜10人的文獻5篇，非人體研究文獻1篇，非黑色素瘤相關研究文獻2篇，組織樣本與血液樣本無法配對的研究文獻2篇，綜述4篇，案例報道1篇和回復信1篇。最終有10篇文獻符合入組標準（圖1）。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 納入文獻基本特征

符合入組標準的10篇文獻中，有4篇來自歐洲，6篇來自北美洲，文獻對象包括1 360例；文獻多發(fā)表于近5年（6/10）；研究對象主要以Ⅲ～Ⅳ期的患者為主（9/10）；ctDNA的檢測方法主要有等位特異聚合酶鏈反應（allele-specific polymerase chain reaction，allelespecific PCR）、擴增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）和BEAMing等。見表1。

2.3 文獻質量評估與發(fā)表偏移

根據QUADAS-2的標準，我們從4個方面對每項研究的方法學質量進行評估（圖2）。在待評價試驗中，有6項研究未提到使用盲法進行測試，另外3項研究是在知道組織檢測結果下進行的研究，因此均存在未知或較大的風險偏移。由于并非所有患者都被納入，或待評價研究與金標準之間存在不恰當?shù)臅r間間隔，因此有8項研究的病例流程和進展情況的偏移風險未知或較高。在所有的研究中，適用性都很高。Deeks'漏斗圖顯示，文獻存在發(fā)表偏移（P=0.03），見圖3。

2.4 異質性檢驗

在診斷試驗中，引起異質性的原因之一就是閾值效應。本研究的Spearman相關系數(shù)為-0.267，P=0.455，提示各項研究間不存在由閾值效應引起的異質性。Q檢驗和I2檢驗結果表明，本研究不存在異質性（合并效應量I2值為0，Q值為1.480，P=0.239）（表2）。因此我們選用固定效應模型進行分析。

2.5 合并診斷效能

如圖4所示，10項研究的合并敏感性為0.71（95%CI為0.63～0.79），合并特異性為0.94（95%CI為0.91～0.96），提示陰性結果的檢出率高；合并AUC為0.94（95%CI為0.92～0.96），說明ctDNA診斷具有較高的準確率（圖5）。DOR值為37（95%CI為19～71），提示ctDNA具有較好的診斷效能。此外，PLR為11.3（95%CI為7.2～17.5），NLR為0.31（95%CI為0.23～0.41）。

表1 入組文獻的基本特征

圖2 文獻質量評價圖

圖3 Deeks'漏斗圖

2.6 特征分析

根據疾病的TNM分期、ctDNA檢測的方法、檢測基因、研究對象例數(shù)等特征進行分析（表2）。來自北美洲的研究合并敏感性為0.76（95%CI為0.69～0.81），合并特異性為0.94（95%CI為0.85～0.98），合并AUC為0.81（95%CI為0.78～0.85），合并DOR為47（95%CI為14～152），合并PLR為12.2（95%CI為4.7～32.1），合并NLR為0.26（95%CI為0.19～0.35），合并后異質性I2=0；來自歐洲的研究合并敏感性為0.60（95%CI為0.48～0.71），合并特異性為0.92（95%CI為0.85～0.96），合并AUC為0.90（95%CI為0.87～0.92），合并DOR為18（95%CI為8～40），合并PLR為7.8（95%CI為4.1～15.0），合并NLR為0.43（95%CI為0.32～0.58），合并后異質性I2=0。相較于來自北美洲的研究，來自歐洲的研究具有更高的AUC，而敏感性、特異性、DOR、PLR值更低。檢測方法不同對結果也有影響，在ARMS-PCR方法組中，合并敏感性為0.61（95%CI為0.51～0.71），合并特異性為0.91（95%CI為0.84～0.95），合并AUC為0.87（95%CI為0.84～0.90），合并DOR為16（95%CI為8～33），合并PLR為6.9（95%CI為3.8～12.6），合并NLR為0.43（95%CI為0.33～0.55），合并后異質性I2=0。另外，人群樣本量大小對結果有影響，在研究對象≤100人的研究中，合并后異質性I2=0，合并敏感性為0.70（95%CI為0.58～0.80），合并特異性為0.91（95%CI為0.82～0.96），合并AUC為0.90（95%CI為0.87～0.92），合并DOR為23（95%CI為8～66），合并PLR為7.7（95%CI為3.5～16.8），合并NLR為0.33（95%CI為0.22～0.49）；在研究對象＞100人的研究中，合并后異質性I2=39，合并敏感性為0.73（95%CI為0.60～0.83），合并特異性為0.95（95%CI為0.92～0.98），合并AUC為0.96（95%CI為0.94～0.97），合并DOR為58（95%CI為26～130），合并PLR為16.1（95%CI為8.8～29.4），合并NLR為0.28（95%CI為0.18～0.43）。

表2 ctDNA在黑色素瘤中診斷價值的特征分析

圖4 敏感性和特異性森林圖

圖5 ctDNA在黑色素瘤中的綜合受試者工作特征曲線

2.7 敏感性分析

為了解研究結果的可靠性，分別逐一排除單項研究，對其余研究進行合并分析，發(fā)現(xiàn)結果可靠。

3 討論

本研究對10篇符合納入標準的文獻進行Meta分析，研究對象共涉及1 360例。Q檢驗和I2檢驗結果表明，合并效應量I2值為0，Q值為1.480，P=0.239，不存在異質性。ctDNA檢測的合并敏感性為0.71（95%CI為0.63～0.79），合并特異性為0.94（95%CI為0.91～0.96），合并AUC為0.94（95%CI為0.92～0.96），其中AUC是一個綜合性指標，值越接近1說明診斷價值越高。合并PLR為11.3，表明黑色素瘤患者中ctDNA檢測出真陽性的概率約是假陽性的11倍。合并NLR為0.31，說明在ctDNA的陰性結果中，可能存在31%的假陰性。DOR是實驗組中陽性結果與對照組中陽性結果的比值，能夠較好地反映出診斷試驗的“鑒別”能力，DOR值與其鑒別能力呈正相關[17]。合并DOR為37，提示ctDNA檢測有較高的綜合診斷效能。

本研究分析了影響ctDNA檢測準確度的因素。BOARD等[13]指出ctDNA水平與腫瘤分期高度相關，ctDNA突變具有腫瘤分期依賴性，一般早期檢測的準確率較低。相較于Ⅰ期患者，Ⅳ期患者的ctDNA更高水平[18]，并且ctDNA水平與腫瘤的轉移有關[19]。此外，腫瘤的異質性可能致使ctDNA和相應的腫瘤組織基因突變檢測結果不一致。腫瘤異質性來自3個方面：腫瘤內、腫瘤間和時間異質性。組織僅代表所取腫瘤組織部位的突變信息，而ctDNA則代表全部腫瘤組織的突變信息[20]。血液樣本的前期處理方式和檢測方法也會影響檢測結果。目前，不同提取試劑盒的ctDNA提取效率差別很大，并且不同提取方法之間無統(tǒng)一的質量判斷標準。敏感性和特異性是評估檢測平臺準確率高低的2個重要指標。根據報道，各種儀器的檢測敏感性不同，二代測序、ARMS-PCR、微滴度聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）和BEAMing的檢測限分別為0.1%～1.0%、0.05%～0.10%、0.001%和0.010%[21-23]。血液中ctDNA水平極低，并且存在正常細胞的DNA干擾，如何有效提取和準確檢測ctDNA是目前亟待解決的問題。

本研究尚存在以下不足：因ctDNA對黑色素瘤診斷一致性方面的研究較少，故入組文獻較少，文獻質量不一，未來仍需納入更多質量較高的研究，并進一步擴大樣本量，對可能產生的異質性因素繼續(xù)研究；納入的10項研究存在發(fā)表偏移，可能是由檢索的數(shù)據庫有限，納入文獻不全導致；納入的文獻以評估ctDNA與組織活檢結果的一致性為評價指標，存在作者偏向于發(fā)表陽性結果的可能性；入組文獻納入的病例數(shù)少，會導致統(tǒng)計結果的準確度受到影響。

基于目前的研究數(shù)據我們發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤患者中，ctDNA與配對的腫瘤組織之間的診斷結果一致性較高。ctDNA具有低創(chuàng)傷、便于動態(tài)監(jiān)測、操作簡便等優(yōu)點，有望成為黑色素瘤基因突變診斷的輔助方法。希望今后能有更多高質量的研究數(shù)據，為ctDNA黑色素瘤基因檢測的臨床應用提供循證醫(yī)學依據。