陸書華， 李曉哲， 劉凌云， 金呈強(qiáng)， 戈寧寧， 董海新

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧 272000）

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（carbapenemresistantEnterobacteriaceae，CRE）的分離率逐年增加。CRE的耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，是臨床抗感染治療的難點(diǎn)。本研究旨在探討濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院CRE的臨床感染特征、藥物敏感性及基因分型，為預(yù)防和治療CRE感染及醫(yī)院多重耐藥菌管理提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2017年7月—2018年12月CRE非重復(fù)臨床分離株，-80℃保存。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）均由我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn) 菌種經(jīng)復(fù)溫、增菌、培養(yǎng)后，根據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第4版）要求進(jìn)行分離培養(yǎng)。所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)及配套革蘭陰性菌鑒定卡（法國(guó)生物梅里埃公司）進(jìn)行細(xì)菌鑒定，并采用VITEK-MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）確證。采用稀釋法測(cè)定CRE最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），抗菌藥物包括替加環(huán)素、頭孢唑啉、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、替卡西林-克拉維酸、阿米卡星、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南、頭孢噻肟、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、厄他培南、氨曲南、復(fù)方磺胺甲噁唑、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢哌酮-舒巴坦、頭孢替坦、妥布霉素、四環(huán)素。頭孢哌酮-舒巴坦采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌環(huán)直徑，結(jié)果判定參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018年版標(biāo)準(zhǔn)；替加環(huán)素采用E試驗(yàn)試紙條（法國(guó)生物梅里埃公司）測(cè)定MIC，結(jié)果判定參照美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局（U. S. Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）推薦的解釋標(biāo)準(zhǔn)，MIC≤2.0 mg/L為敏感，MIC=4.0 mg/L為中介，MIC≥8.0 mg/L為耐藥。

1.2.2 簡(jiǎn)易碳青霉烯類滅活（simplified carbapenem inactivation method，sCIM）試驗(yàn) 將過(guò)夜生長(zhǎng)的大腸埃希菌（ATCC 25922）用肉湯調(diào)到0.5麥?zhǔn)蠁挝?，直接涂布于M-H平板，將直接粘取待測(cè)CRE后的亞胺培南藥物敏感性試驗(yàn)紙片放入涂有大腸埃希菌（ATCC 25922）的M-H平板，35 ℃培養(yǎng)16～18 h后，測(cè)量抑菌環(huán)直徑，抑菌環(huán)直徑＜20 mm或?yàn)?1～22 mm，環(huán)中大腸埃希菌菌落出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象為陽(yáng)性；抑菌環(huán)直徑＞25 mm為陰性；介于二者之間為不確定[1]。

1.2.3 Xpert Carba-R檢測(cè) 將大腸埃希菌（ATCC 25922）及待測(cè)菌株用0.9%氯化鈉溶液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬? mL菌液放入樣本處理液中，渦旋震蕩10 s，用新的移液管取2 mL液體加入試劑匣，然后放入儀器檢測(cè)，約1 h后讀取結(jié)果。

1.2.4 基因檢測(cè) 采用加熱煮沸法（100 ℃干浴10 min）提取菌株DNA模板，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48基因序列，引物信息見表1，引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[2-3]。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 45 s變性；退火時(shí)間35 s，72 ℃ 50 s延伸，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min再延伸。于2%瓊脂糖凝膠中擴(kuò)增產(chǎn)物，用GelRed核酸染色劑染色，在Gel-Box凝膠成像系統(tǒng)中拍照并記錄結(jié)果?；厥疹A(yù)期目的片段大小一致的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所得堿基基因序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，確證擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型別。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET 5.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 碳青霉烯酶PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 CRE分離情況

2017年7月—2018年12月，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院送檢CRE的患者231例，有87例檢出CRE，其中6例患者不同部位的臨床樣本中同時(shí)檢出CRE。剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株，本研究納入CRE 93株。

2.1.1 CRE樣本來(lái)源 93株CRE臨床分離株中，有52株（55.91%）分離自痰液樣本，11株（11.83%）分離自血液樣本，8株（8.60%）分離自中段尿樣本，5株（5.38%）分離自肺泡灌洗液樣本，4株（4.30%）分離自分泌物樣本，膿液、膽汁樣本中各分離出3株（3.23%），腦脊液、穿刺液和引流液樣本中各分離出2株（2.15%），胸水樣本中分離出1株（1.07%）。

2.1.2 CRE科室分布 CRE主要分離自重癥監(jiān)護(hù)病房（45株，48.39%），以下依次為：康復(fù)科（9株，9.68%），呼吸內(nèi)科（6株，6.45%），血液科（5株，5.38%），肝膽科、創(chuàng)傷骨科、兒科各4株（4.30%），神經(jīng)內(nèi)科、急診科各3株（3.23%），神經(jīng)外科監(jiān)護(hù)病房、腎內(nèi)科各2株（2.15%），泌尿科、燒傷科、神經(jīng)外科、胃腸外科、手足外科、小兒外科各1株（1.08%）。

2.1.3 CRE菌種分布 93株CRE臨床分離株中，肺炎克雷伯菌59株（63.44%）、大腸埃希菌29株（31.18%）、陰溝腸桿菌4株（4.30%）、弗勞地檸檬酸桿菌1株（1.08%）。

2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

93株CRE對(duì)24種臨床常用抗菌藥物的耐藥率見表2。

表2 CRE對(duì)24種抗菌藥物的耐藥率 %

2.3 sCIM試驗(yàn)結(jié)果

93株CRE臨床分離株中，有79株（84.95%）產(chǎn)碳青霉烯酶，其中肺炎克雷伯菌52株、大腸埃希菌23株、陰溝腸桿菌3株、弗勞地檸檬酸桿菌1株。部分結(jié)果見圖1。

2.4 Xpert Carba-R檢測(cè)結(jié)果

79株產(chǎn)碳青霉烯酶CRE中，KPC基因陽(yáng)性38株（48.10%），NDM基因陽(yáng)性31株（39.24%），IMP基因陽(yáng)性6株（7.59%），NDM+KPC基因陽(yáng)性4株（5.06%），未檢出VIM及OXA-48 耐藥基因。

圖1 部分sCIM試驗(yàn)結(jié)果

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.5 PCR基因擴(kuò)增結(jié)果

52株肺炎克雷伯菌中，38株攜帶KPC耐藥基因，10株攜帶NDM耐藥基因，4株同時(shí)攜帶KPC和NDM耐藥基因。23株大腸埃希菌中，18株攜帶NDM耐藥基因，5株攜帶IMP耐藥基因。3株陰溝腸桿菌中，2株攜帶NDM耐藥基，1株攜帶IMP耐藥基因。1株弗勞地檸檬酸桿菌攜帶NDM耐藥基。有14株CRE未檢出本研究涉及的耐藥基因，未檢出VIM及OXA-48耐藥基因。擴(kuò)增產(chǎn)物KPC測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因登錄號(hào)（KU680813.1）完全一致，即為KPC-2；擴(kuò)增產(chǎn)物IMP測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因登錄號(hào)（KU051710.1）完全一致，即為IMP-4；擴(kuò)增產(chǎn)物NDM測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因登錄號(hào)（JF826285.1 ）完全一致，即為NDM-1。見圖2。

3 討論

近年來(lái)，CRE在世界范圍內(nèi)散發(fā)或暴發(fā)流行，對(duì)全球的公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大威脅[4]，2017年，世界衛(wèi)生組織將CRE列為21世紀(jì)最重要的耐藥病原菌之一。目前CRE分離率較高的國(guó)家除我國(guó)外，還包括希臘、意大利、巴西，以及美國(guó)和哥倫比亞[5-6]。有研究結(jié)果表明，2014—2015年，我國(guó)27個(gè)省市的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌的碳青霉烯類耐藥率分別為8%和2%；收集的999株CRE中，肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、腸桿菌科細(xì)菌所占比例分別為70%、16%和13%，其中92%的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌產(chǎn)碳青霉烯酶；KPC（63%）和NDM（34%）仍是主要的產(chǎn)酶類型，且有2%的菌株同時(shí)表達(dá)KPC和NDM基因[7]。

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院CRE的分離率也在逐年增加，2015年上報(bào)多重耐藥菌1 245株，其中CRE 24株（1.93%）；2016年上報(bào)多重耐藥菌1 406株，其中CRE 30株（2.13%）；2017年上報(bào)多重耐藥菌2 463株，其中CRE 100株（4.06%）；2018年上報(bào)多重耐藥菌2 703株，其中CRE 166株（6.14%）。CRE主要分離自痰液樣本，其次是血液和尿液樣本，這與濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院樣本結(jié)構(gòu)有關(guān)。CRE主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房，可能與重癥監(jiān)護(hù)病房患者病因復(fù)雜且病情危重，高效廣譜抗菌藥物使用率高和有創(chuàng)操作治療較多有關(guān)[8]。

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類耐藥的機(jī)制包括產(chǎn)碳青霉烯酶和非產(chǎn)碳青霉烯酶2類，其中產(chǎn)碳青霉烯酶是主要的耐藥機(jī)制。碳青霉烯酶基因常位于MDR質(zhì)粒上，可在不同腸桿菌科細(xì)菌之間傳播。按照Ambler分子分類方法可將碳青霉烯酶分為A、B、D 3類，A類包括KPC、IMI、NMC、SME和GES等，B類也稱為金屬酶，包括IMP、VIM、NDM、SPM和GIM等，D類包括OXA-48、OXA-181、OXA-204和OXA-232。其中，A類酶中的KPC，B類酶中的NDM、VIM和IMP，以及D類酶中的OXA-48是腸桿菌科細(xì)菌中最常見的碳青霉烯酶。

實(shí)驗(yàn)室可以通過(guò)碳青霉烯酶表型試驗(yàn)或碳青霉烯酶耐藥基因的分子生物學(xué)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)CRE。碳青霉烯酶表型檢測(cè)試驗(yàn)包括改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)、碳青霉烯類滅活（carbapenem inactivation method，CIM）試驗(yàn)、乙二胺四乙酸-碳青霉烯類滅活（ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM）試驗(yàn)等[9]。近年來(lái)也有研究者通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)碳青霉烯類抗菌藥物的水解來(lái)檢測(cè)碳青霉烯酶的活性。本研究采用一種新的碳青霉烯酶表型確證方法——sCIM，檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶，sCIM與mCIM檢測(cè)原理相似，都是基于碳青霉烯酶能水解碳青霉烯類抗菌藥物，但sCIM操作方法較mCIM更簡(jiǎn)單，更加適合臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作，在分析的93株CRE臨床分離株中，84.95%產(chǎn)生碳青霉烯酶，與ZHANG等[10]的研究結(jié)果基本一致。本研究采用Xpert Carba-R，48 min檢測(cè)KPC、NDM、VIM、OXA和IMP-1 5種碳青霉烯酶基因，是目前唯一可快速檢測(cè)并鑒別多種碳青霉烯酶基因的即時(shí)分子診斷方法，可直接檢測(cè)尿、拭子等臨床樣本，樣本處理只需簡(jiǎn)單的3個(gè)步驟，耗時(shí)僅1 min，上機(jī)檢測(cè)后48 min即可獲得檢測(cè)結(jié)果，每種基因的檢測(cè)下限都可達(dá)102 CFU/拭子，可快速發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯酶菌株定植患者。Xpert Carba-R對(duì)應(yīng)的敏感性及特異性分別為94.5%和100%，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)僅48 min，為最快出結(jié)果的檢測(cè)方法。通過(guò)檢測(cè)及結(jié)果對(duì)比，sCIM試驗(yàn)確證碳青霉烯酶表型與PCR金標(biāo)準(zhǔn)的符合率為100%，Xpert Carba-R碳青霉烯酶檢出率與PCR金標(biāo)準(zhǔn)的符合率為100%。綜合多種CRE檢測(cè)方法，本研究建議使用sCIM法簡(jiǎn)便地確證腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶，對(duì)于急癥患者宜采用Xpert Carba-R檢測(cè)并鑒別碳青霉烯酶分型。

本研究測(cè)序驗(yàn)證后的結(jié)果表明，93株CRE中有79株產(chǎn)碳青霉烯酶，其他為非產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，可能為高產(chǎn)AmpC酶或超廣譜β-內(nèi)酰胺酶合并外膜蛋白缺失以及外排泵過(guò)表達(dá)聯(lián)合外膜蛋白缺失所致。本研究中88%（52/59）的肺炎克雷伯菌，79%（23/29）的大腸埃希菌和75%（3/4）的陰溝腸桿菌攜帶碳青霉烯酶基因。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶耐藥基因主要為KPC型，大腸埃希菌主要為NDM型，與WANG等[11]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)楫a(chǎn)KPC和NDM型耐藥基因均可由質(zhì)粒介導(dǎo)，可通過(guò)菌株自身克隆以及不同菌種間水平轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致耐藥菌株的廣泛傳播。

目前，碳青霉烯類抗菌藥物是唯一可選的治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性細(xì)菌感染的抗菌藥物，然而CRE不但可以水解碳青霉烯類藥物，而且可以使頭孢菌素類、青霉素類等抗菌藥物失效，并對(duì)其他種類的抗菌藥物不同程度耐藥[12]。 使用單一抗菌藥物進(jìn)行治療的成功率非常低，只有多種抗菌藥物聯(lián)合使用才能提高成功率。

綜上所述，CRE管理的核心問題在于：（1）快速甄別產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，遏制其快速發(fā)展；（2）確定早期、快速篩查的方法，并結(jié)合全基因組測(cè)序等多種方法，對(duì)CRE感染快速溯源其傳播鏈條；（3）探索基于體外MIC的聯(lián)合方案下不同藥物組合[13]。臨床醫(yī)師需要準(zhǔn)確掌握細(xì)菌耐藥情況，根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗菌藥物，減少耐藥菌的產(chǎn)生。

本研究明確了濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院CRE的臨床分布特征及耐藥基因，有助于及時(shí)遏制CRE的持續(xù)感染與流行，降低醫(yī)院CRE感染發(fā)生率，協(xié)助臨床醫(yī)師制定抗菌藥物使用策略，為醫(yī)院多重耐藥菌管理提供參考。