王 芬，成少寧，喬 冬

（運(yùn)城職業(yè)技術(shù)大學(xué) 健康學(xué)院，山西 運(yùn)城044000）

紫米又稱“紫珍珠”，米粒細(xì)長顏色紫黑，在我國湖南、云南、四川、貴州、陜西等地有少量栽培，是一種珍稀谷類。紫米味甘、性溫，《本草綱目》記載紫米有滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血、抗癌和預(yù)防心臟病等作用[1]。與普通大米相比，紫米含有更為豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、礦物質(zhì)以及花色苷、黃酮類和酚酸類等生物活性物質(zhì)，使得紫米越來越受到消費(fèi)者的青睞[2-6]。

酸奶作為一種以牛奶或乳粉為原料的發(fā)酵乳制品，因其營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特、含有活性乳酸菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)消化吸收等功能，在市場上廣受消費(fèi)者歡迎，近兩年其產(chǎn)銷量增長速度均高達(dá)40%以上。隨著“健康中國2030”國民營養(yǎng)計(jì)劃的開啟，消費(fèi)者的營養(yǎng)健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，具有功能性的谷物酸奶的研究開發(fā)逐漸成為熱點(diǎn)[7-8]。目前關(guān)于紫米酸奶的研究報(bào)道比較少，付亮等[9]以西瓜汁和紫米漿為主要原料研制復(fù)合酸奶，通過正交試驗(yàn)確定了最佳配方。

本試驗(yàn)將紫米炒制、磨粉后加入牛奶中，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵制成一種營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特的功能性谷物酸奶，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，研究紫米酸奶在貯藏過程中品質(zhì)的變化及對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率，為紫米深加工探索新途徑，進(jìn)一步豐富市場酸奶種類，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

鮮牛奶、白砂糖：市售；紫米：產(chǎn)自云南省墨江哈尼族自治區(qū)；保加利亞乳桿菌（Lactobncillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、無水乙醇：廣東光華化學(xué)廠有限公司；氯化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、硫酸、無水乙醚、石油醚：天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；碘、氨水：南京化學(xué)試劑股份有限公司；試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉粉3.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸鈣10.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，1%中性紅溶液5.0 mL。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，七水合磷酸氫二鉀2.0 g，三水醋酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，七水硫酸鎂0.2 g，四水硫酸錳0.05 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌15～20 min。

煌綠乳糖膽鹽肉湯（brilliant green lactose bile broth，BGLB）培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1/10000g220gCPA224S電子分析天平：德國賽多利斯有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9203A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PB-10 pH計(jì)：德國賽多利斯有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；GYB40-10S高壓均質(zhì)機(jī)：上海東華試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；722N-分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫米酸奶加工工藝流程及操作要點(diǎn)

紫米粉的制備：選取顆粒飽滿，無蟲害的紫米，淘洗一次，瀝干后，采用炒制機(jī)對(duì)紫米進(jìn)行翻炒，再用高速萬能粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，并過100目篩，得到熟紫米粉[10]。

鮮牛奶檢驗(yàn)：按照GB 19301—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)生乳》要求的方法對(duì)鮮牛乳的蛋白質(zhì)、脂肪、雜質(zhì)度、非脂乳固體、微生物等指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果均符合國標(biāo)要求的鮮牛奶可作為原料乳。

混合、均質(zhì)、滅菌：將紫米粉加入檢驗(yàn)合格的鮮牛奶中，高速攪拌機(jī)混合均勻，在65 ℃、20 MPa條件下均質(zhì)3 min，95 ℃滅菌15 min，得紫米鮮牛奶混合液。

接種、灌裝、發(fā)酵：將滅菌的混合液冷卻至42 ℃，加入菌種（保加利亞桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1），灌裝，密封，放入42 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵4～6 h，待達(dá)到凝固狀態(tài)，酸度達(dá)到70°T時(shí)停止發(fā)酵[11-13]。

后熟：將發(fā)酵完畢的酸奶在4 ℃條件下冷藏24 h，得到紫米酸奶成品。

1.3.2 紫米酸奶的工藝優(yōu)化試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)：以滴定酸度，持水力和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量在不同水平上對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響，確定每項(xiàng)因素的最優(yōu)值。設(shè)定白砂糖添加量為7%，接種量為0.05%，將紫米粉添加量設(shè)定為0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，考察紫米粉添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響；設(shè)定接種量為0.05%，紫米粉添加量為20 g/L，將白砂糖添加量水平設(shè)定為5%、6%、7%、8%、9%、10%，考察白砂糖添加量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響；設(shè)定紫米粉添加量為20 g/L，白砂糖添加量為7%，將接種量水平設(shè)定為0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%，考察接種量對(duì)酸奶品質(zhì)的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接種量（C）3個(gè)因素為試驗(yàn)因素，酸奶的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)紫米酸奶的工藝進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 紫米酸奶的貯藏品質(zhì)測(cè)定

在最優(yōu)工藝條件下制備紫米酸奶，以不添加紫米的酸奶為對(duì)照，對(duì)酸奶進(jìn)行感官評(píng)價(jià)及酸度、pH值、持水力、乳酸菌總數(shù)和DPPH自由基清除率測(cè)定，并測(cè)定紫米酸奶在0～4℃條件下貯藏0d、1d、5d、9d、13d、17d、21d的貯藏品質(zhì)。

1.3.4 分析檢測(cè)

（1）感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10名專業(yè)的品評(píng)人員對(duì)紫米酸奶進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)價(jià)從色澤、組織狀態(tài)、氣味和滋味4個(gè)方面進(jìn)行，滿分100分，結(jié)果以平均值計(jì)，紫米酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 紫米酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of purple rice yogurt

續(xù)表

（2）理化指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中的指標(biāo)要求，對(duì)酸奶中的脂肪含量、非脂乳固體含量、蛋白質(zhì)含量和酸度分別依據(jù)：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》、GB5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測(cè)定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》和GB 5009.239—2016《食品酸度的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；pH值測(cè)定：參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》；持水力測(cè)定：參考麻澤宇等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。

（3）微生物指標(biāo)測(cè)定

乳酸菌總數(shù)測(cè)定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》分別計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌數(shù)和保加利亞桿菌數(shù)，兩者之和即為乳酸菌總數(shù)。大腸菌群：按照GB4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》中的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。致病菌按照GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》中的方法進(jìn)行測(cè)定。

（4）DPPH自由基清除率測(cè)定

參考胡錦濤等[15-18]的方法對(duì)紫米酸奶的DPPH自由基清除率進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 紫米粉添加量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響

表3 紫米粉添加量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 3 Effect of purple rice flour addition on purple rice yogurt quality

由表3可知，紫米酸奶的酸度、持水力和感官評(píng)分隨著紫米粉添加量的增加，出現(xiàn)不同的變化。其中紫米酸奶的酸度隨著紫米粉添加量的增加而升高，這可能是因?yàn)樽厦追壑械牡途厶堑瘸煞忠部勺鳛榘l(fā)酵基質(zhì)，促進(jìn)了乳酸菌產(chǎn)酸量的增加；紫米酸奶的持水力隨著紫米粉添加量的增加而升高，這主要是因?yàn)樽厦椎矸鄣奈暂^強(qiáng)，表現(xiàn)為酸奶的持水力逐漸升高；紫米酸奶的感官評(píng)分隨著紫米粉添加量的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)紫米粉添加量達(dá)到20 g/L時(shí)，酸奶呈乳白色略帶紫色，既有發(fā)酵乳的香味又有紫米香味，組織細(xì)膩無乳清析出，當(dāng)紫米粉添加量＞20 g/L時(shí)，酸奶紫米氣味過重、掩蓋酸奶的香味、組織粗糙且紫米淀粉經(jīng)過糊化冷卻后，導(dǎo)致酸奶凝乳不佳出現(xiàn)分層。因此，紫米粉添加量20 g/L為宜。

2.1.2 白砂糖添加量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響

表4 白砂糖添加量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 4 Effect of sucrose addition on purple rice yogurt quality

由表4可知，隨著白砂糖添加量的增加，酸奶的酸度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，這是由于白砂糖含量的增加為乳酸菌的生長提供了充足的碳源，促進(jìn)了乳酸菌的產(chǎn)酸從而導(dǎo)致酸度增大。隨著白砂糖添加量的增加，酸奶的持水力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在白砂糖添加量達(dá)到7%時(shí)，酸奶的持水力達(dá)到最高。酸奶的感官評(píng)分隨著白砂糖添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在白砂糖添加量達(dá)到7%時(shí)，酸奶的感官評(píng)分達(dá)到最高，此時(shí)產(chǎn)品酸甜可口，口味最佳。當(dāng)白砂糖添加量＞7%，酸奶口感偏甜，感官評(píng)分下降。因此，白砂糖添加量7%為宜。

2.1.3 接種量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響

表5 接種量對(duì)紫米酸奶品質(zhì)的影響Table 5 Effect of inoculum on purple rice yogurt quality

由表5可知，當(dāng)接種量＜0.05%時(shí)，制作的酸奶產(chǎn)酸量少，持水力差，凝乳狀態(tài)不佳，酸奶組織不細(xì)膩，乳清析出較多，酸奶感官評(píng)分不高。當(dāng)接種量達(dá)到0.05%時(shí)，乳酸菌產(chǎn)酸量增加，此時(shí)制作的酸奶酸度升高，酸奶凝固狀態(tài)良好，持水力增加，組織細(xì)膩，感官評(píng)分最高。當(dāng)接種量＞0.05%時(shí)，隨著接種量的增加，乳酸菌產(chǎn)酸過多，口感偏酸，酸奶凝乳過度，導(dǎo)致乳清析出，持水力和感官評(píng)分均下降。因此，接種量0.05%為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

選取紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接種量（C）3個(gè)因素為自變量，酸奶的感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)紫米酸奶的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。利用Design-Expert V8.0.6 軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次擬合分析以及方差分析，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 6 Results of Box-Behnken experiments design

利用Design-Expert V8.0.6軟件，對(duì)表6結(jié)果進(jìn)行多元二次擬合分析，得回歸方程：Y=90.06+1.05A+1.54B+1.04C-0.20AB+0.50AC+0.38BC-2.57A2-2.49B2-1.24C2。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

由表7可知，酸奶工藝優(yōu)化回歸模型（P值=0.0001＜0.01），模型極顯著，失擬項(xiàng)（P值=0.843 5＞0.05）不顯著，表示試驗(yàn)操作誤差很小，其決定系數(shù)為R2=0.970 9，說明該模型是擬合良好的模型，可以用于紫米酸奶的工藝優(yōu)化。分析各因素的F值和P值可知，一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)紫米酸奶感官評(píng)分影響均極顯著（P＜0.01）。對(duì)A、B、C三個(gè)因素影響程度分析可知：B＞A＞C，即白砂糖添加量＞紫米粉添加量＞接種量。

2.2.1 響應(yīng)面曲面分析

紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量三個(gè)因素之間的交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖1。由圖1可知，3個(gè)響應(yīng)面圖都是開口向下的，說明紫米酸奶感官評(píng)分在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。根據(jù)Design-Expert V8.0.6軟件分析得出紫米酸奶的最佳配方工藝為紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接種量0.06%。在此優(yōu)化條件下，紫米酸奶的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為90.7分。

圖1 紫米粉添加量、白砂糖添加量和接種量交互作用對(duì)紫米酸奶感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 1 Response surface plots and contour lines of the interaction between purple rice power addition, sugar addition and inoculum on sensory quality of purple rice yogurt

2.2.2 紫米酸奶工藝配方優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)

在紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接種量0.06%的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值得到感官評(píng)分實(shí)際值為91.1分，真實(shí)值與回歸模型預(yù)測(cè)值之間的偏差是0.4%（＜1%），說明此模型良好。

2.2.3 紫米酸奶品質(zhì)分析

按照GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中的指標(biāo)要求對(duì)最佳工藝制作的紫米酸奶的脂肪、非脂乳固體、蛋白質(zhì)、酸度、乳酸菌總數(shù)、大腸菌群和致病菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表8。

表8 紫米酸奶理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 8 Determination results of physicochemical and microbial indicators of purple rice yogurt

由表8可知，紫米酸奶的理化及微生物指標(biāo)均滿足國標(biāo)GB 19302—2010要求，表明用最佳工藝制作的紫米酸奶營養(yǎng)豐富、品質(zhì)良好。

2.3 紫米酸奶的貯藏品質(zhì)

由圖2a～圖2d可知，在貯藏期間紫米酸奶和對(duì)照酸奶的感官評(píng)分和持水力均隨著貯藏時(shí)間的延長而下降，而紫米酸奶的感官評(píng)分和持水力均高于對(duì)照酸奶。在pH值和酸度兩個(gè)指標(biāo)方面，紫米酸奶的pH值高于對(duì)照酸奶，隨著貯藏時(shí)間的延長pH值均呈下降趨勢(shì)；紫米酸奶的酸度低于對(duì)照酸奶，隨著貯藏時(shí)間的延長均呈上升的趨勢(shì)。由圖2e可知，紫米酸奶的乳酸菌總數(shù)在貯藏期間一直高于對(duì)照酸奶，均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且均在貯藏13 d時(shí)達(dá)到最大值。說明紫米粉能促進(jìn)乳酸菌的增殖，紫米酸奶的貯藏品質(zhì)優(yōu)于對(duì)照酸奶。由圖2f可知，紫米酸奶對(duì)DPPH自由基清除率高于對(duì)照酸奶，且兩者均隨著貯藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)樗崮淘诎l(fā)酵過程中產(chǎn)生的多肽、氨基酸具有一定的抗氧化能力[19]，而紫米中的花色苷、黃酮類和酚酸類生理活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力[20-21]，因此紫米粉的添加可以增加酸奶的DPPH自由基清除率。在酸奶貯藏期間，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酸奶中的抗氧化成分不斷增加，使得兩種酸奶對(duì)DPPH自由基清除能力不斷增強(qiáng)。

圖2 紫米酸奶貯藏期間品質(zhì)變化Fig. 2 Changes of purple rice yogurt quality during storage

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，響應(yīng)面法得到紫米酸奶最優(yōu)的工藝為紫米粉添加量為22 g/L，白砂糖添加量為7%，接種量為0.06%。在此工藝條件下，紫米酸奶的感官評(píng)分為91.1分，與理論預(yù)測(cè)值90.7分比較接近，表明該模型擬合程度較好。紫米酸奶品質(zhì)分析結(jié)果顯示，紫米酸奶的各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)均符合國標(biāo)要求。在貯藏期間，紫米酸奶的感官評(píng)分、持水力、pH、酸度、乳酸菌總數(shù)均優(yōu)于對(duì)照酸奶，且紫米酸奶的DPPH自由基清除率明顯高于對(duì)照酸奶。紫米酸奶是一款貯藏品質(zhì)穩(wěn)定，具有更長的貨架期和較強(qiáng)抗氧化能力的谷物酸奶。