李 斌，錢云開，肖艷霞，單 超，柳吉芹，高 飛，王海洋，王傳現(xiàn)，鄒 靜，閻賀靜

（1.秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，河北 秦皇島066004；2.河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島066004；3.上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海200135）

醋酸菌屬于醋桿菌科（Acetobacteriaceae），目前有11個屬中的46種被認(rèn)為是醋酸菌[1]，其中絕大部分的醋酸菌存在于發(fā)酵食品中的醋、酸奶、泡菜和葡萄酒中[2-5]。醋酸菌是革蘭氏陰性專性好氧菌，是葡萄酒生產(chǎn)過程中的有害微生物之一，它能夠?qū)⒁掖佳趸梢胰┖痛姿?，使酒中的揮發(fā)酸含量增高，受醋酸菌污染的葡萄酒明顯會有醋酸味產(chǎn)生，因此控制葡萄酒中的醋酸菌顯得尤為重要[6-9]。目前國內(nèi)醋酸菌的檢測方法通常是在固體選擇培養(yǎng)基上分離，然后鑒定其生理生化特性[10]，還有一些方法是針對醋酸菌中的個別物種設(shè)計了實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timepolymerase chain reaction，RT-PCR）的方法，GAMMON K S等[11]成功運用RT-PCR技術(shù)檢測了電解質(zhì)飲料中微量的葡萄糖桿菌，VALERA M J等[12]設(shè)計16S～23S r RNA間區(qū)序列的2個特異性探針，成功定量檢測了醋酸菌Acetobacter malorum和Acetobacter cerevisiae的數(shù)量。但大多數(shù)的醋酸菌卻不能在食品和環(huán)境樣品中被檢測到。

實時熒光PCR技術(shù)特異性強，靈敏度高，重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用到檢測過程中[13]。而在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在葡萄酒中存在大量的單寧、多糖和色素，這些成分作PCR抑制因子在進(jìn)行RT-PCR時可能會成為干擾實驗準(zhǔn)確性的存在[14]。PCR抑制劑通常通過與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）直接相互作用或?qū)岱€(wěn)定DNA聚合酶的干擾而發(fā)揮作用，會影響PCR的擴增效率，所以在實際樣品檢測過程中，應(yīng)使用生理鹽水對葡萄酒進(jìn)行洗脫，以排除干擾因素對基因組的提取[15]。

在本研究中，參考了KIM D H等[16]設(shè)計的引物序列，利用SYBR Green I染料法[17]，建立了一種應(yīng)用到葡萄酒中醋酸菌檢驗的實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantative polymerase chain reaction，RT-FQPCR）檢測方法來快速檢測葡萄酒中是否含有醋酸菌群，以此來對葡萄酒釀造過程中的醋酸菌群進(jìn)行快速檢測，并做出預(yù)警分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和檢測樣品

醋酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株7株，分別為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、食蔗糖駒形氏桿菌（Acetobacter pasteurianus）、氧化葡萄糖桿菌（Gluconobacter oxydans）、日本葡糖桿菌（Gluconobacter japonicas）、蠟狀葡糖桿菌（Gluconobacter cerinus）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）及熱帶醋桿菌（Acetobacter tropicalis）；其他非醋酸菌株7株，分別為金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、志賀菌（Shigella sonnei）、鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of indus trial culture collection，CICC）和中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）；腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）來自實驗室分離菌種。

紅葡萄酒（賽曦吉普斯蘭黑比諾、麥格根·黑牌、2015拜倫灣西拉子），白葡萄酒（愛在深秋、駿馬酒莊霞多麗、駿馬酒莊霞多麗、卡聶高金伯爵、康斯汀特），桃紅葡萄酒（拉亞莫斯卡托），冰酒（VQA維達(dá)爾）：市場抽樣。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

X3R高速冷凍離心機：美國Thermo公司；PCR System 7900基因擴增儀、StepOnePlus實時定量熒光PCR儀、SYBR Green Master Mix：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌培養(yǎng)條件

7株醋酸菌在無菌環(huán)境下各挑取一菌環(huán)于醋酸菌培養(yǎng)基上劃線，在需氧條件下30 ℃培養(yǎng)4～5 d。

1.3.2 基因組DNA的提取

7株醋酸菌經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)后，將長勢處于指數(shù)生長期的醋酸菌，參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取核酸[18]。其他非醋酸菌也參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取核酸。

1.3.3 引物組

引物組：K-AAB_F：5'-AAGGGGGCTAGCGTTGCTCG-3'；K-AAB_R：5'-ACCGCCTACACGCCCTTTACG-3'。

1.3.4 RT-FQPCR反應(yīng)體系

RT-FQPCR反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR Green Master Mix 12.5 μL，上游引物K-AAB_F 0.5 μL，下游引物K-AAB_R 0.5 μL，DNA模板2 μL，超純水9.5 μL。

RT-FQPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃、5 s；62 ℃、34 s；循環(huán)45次，熔解曲線測定程序溫度（0.5 ℃/s）速率從65 ℃升至95 ℃，同時收集熒光數(shù)據(jù)。

1.3.5 葡萄酒中DNA的提取

吸取1 mL葡萄酒樣，8 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入200 μL生理鹽水（0.85%）漩渦混勻，12 000 r/min離心2 min，所得沉淀按上述方法洗滌2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性實驗結(jié)果

利用醋酸菌通用引物，以7種醋酸菌的DNA模板為陽性對照，剩余5種常見病原菌（金葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、大腸桿菌（Escherichia coli）、志賀菌（Shigella sonnei）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium））和2種益生乳酸菌（腸膜明串珠菌（leuconostoc mesenteroides）和乳酸乳球菌（lactococcus lactis））的DNA為模板為陰性對照，以無菌去離子水為空白對照，按照1.3.4中的反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴增曲線Fig. 1 Amplification curve of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction specific

由圖1可知，7株醋酸菌出現(xiàn)陽性擴增曲線，其他非醋酸菌熒光信號均在閾值以內(nèi)，空白對照也無擴增曲線，說明引物特異性良好。葡萄酒添加實驗過程中的陰性對照和空白對照在擴增曲線中出現(xiàn)少量翹尾現(xiàn)象，分析得DNA模板提取過程中存在污染現(xiàn)象或成品酒中存在少量醋酸菌被檢測出。由于出現(xiàn)的量很少，不干擾實驗的進(jìn)行。

2.2 不同菌株靈敏度實驗結(jié)果

為了驗證不同菌株的靈敏度，對7種醋酸菌用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，菌液濃度稀釋至10-7，按照1.3.4的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-FQPCR擴增，同時進(jìn)行平板計數(shù)?；罹嫈?shù)（CFU/mL）=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5，計算得到最低檢出限，結(jié)果見表1。

表1 菌落計數(shù)結(jié)果Table 1 Results of colony count

由表1可知，7株醋酸菌在不同菌液稀釋倍數(shù)下的菌落計數(shù)結(jié)果值各不相同，選取每種醋酸菌能被活菌計數(shù)的最低稀釋度得到結(jié)果：氧化葡萄糖桿菌最低檢出限240 CFU/mL、醋化醋桿菌最低檢出限60 CFU/mL、日本葡糖桿菌最低檢出限105 CFU/mL、巴氏醋桿菌最低檢出限125 CFU/mL熱帶醋桿菌最低檢出限60 CFU/mL、蠟狀葡糖桿菌最低檢出限270 CFU/mL和食蔗糖駒形氏桿菌最低檢出限35 CFU/mL，綜合檢測限為124 CFU/mL，符合活菌計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[19-20]

根據(jù)擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時所

對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct）值（y）與菌液稀釋

倍數(shù)的對數(shù)值（x）制作醋酸菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

圖2 7株醋酸菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curves of 7 acetic acid bacteria strains

表2 7株醋酸菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of 7 acetic acid bacteria strains

由圖2及表2可知，檢測到7株醋酸菌標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均可達(dá)到0.9以上，檢測結(jié)果可靠，可以用作定量分析。

2.4 醋酸菌株添加葡萄酒中檢測結(jié)果

以不加醋酸菌的葡萄酒為陰性對照，無菌去離子水為空白對照，參考表1中每株醋酸菌在不同菌濃下的檢測限，混勻吸取5 mL醋酸菌菌液加入45 mL葡萄酒中，按照1.3.4的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-FQPCR擴增，結(jié)果見表3。

表3 醋酸菌株添加葡萄酒中檢測結(jié)果Table 3 Determination results of acetic acid bacteria strains addition in wines

由表3可知，7株醋酸菌添加到成品葡萄酒中均可被檢測出，而在不添加醋酸菌的葡萄酒和空白對照中均未檢出，表明此方法可用于實際生產(chǎn)過程中。

3 結(jié)論

本研究依據(jù)醋酸菌通用引物進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化并通過7株醋酸菌，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增。結(jié)果表明此方法綜合靈敏度可達(dá)124 CFU/mL，該方法對醋酸菌具有良好的特異性，耗時短，通用性強在實際樣品中的實驗結(jié)果也真實可靠，能夠快速檢測葡萄酒釀造過程中的醋酸菌，可應(yīng)用于實驗室檢測或者實際生產(chǎn)過程，具有實際意義。