左 勇，何頌捷，秦世蓉，楊建飛，徐 佳，黃雪芹，陳 靜，宋 華

（1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓644000；2.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓644000；3.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都610101；4.四川施利旺農業(yè)科技開發(fā)有限公司，四川 宜賓644000）

我國是農業(yè)大國[1]，化肥年使用量占世界近40%，居世界第一位，超過了美國、印度的總和[2]。由于過量使用化肥，極大危及農產品質量安全和人體健康[3]，因此傳統(tǒng)的化肥已不能適應農業(yè)發(fā)展的需要，為實現(xiàn)農產品可持續(xù)發(fā)展，發(fā)展高效環(huán)保的生物有機肥勢在必行[4]。

生物有機肥是特定功能微生物與動植物殘體、農作物秸稈等為來源并經無害化處理、腐熟的有機物料復合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應的肥料[5]。生物有機肥和飼料的原料主要來源于秸稈、豆粕、棉粕、菜籽餅、酒糟、醋糟、木薯渣、糖渣、糠醛渣、鋸末、餐廚垃圾、菜市場尾菜等，由于纖維素不易被降解利用，因此現(xiàn)階段國內施用生物有機肥的積極性不高，使用率相對較低[6-7]。

在生物有機肥的生產過程中，加入高酶活的菌種，能縮短有機肥的發(fā)酵周期，提高產品質量[8]。目前，自然分離的菌種產纖維素酶能力較低[9]，其酶活很難滿足大規(guī)模工業(yè)生產應用的需求[10]。誘變育種就是利用誘變劑加以處理，提高誘變對象的突變頻率，最后通過相應的篩選方式來提高菌種能力，誘變育種主要分為物理誘變和化學誘變。其中物理誘變中以紫外線輻射的使用最為普遍，其他誘變因子則受到現(xiàn)階段設備條件的限制，還未能大量普及。紫外線作為物理誘變用于工業(yè)微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，近幾年紫外誘變依舊作為首選[11]，化學誘變劑常用于處理遲變突變，對某特定的基因或核酸有選擇性作用[12-13]。因此本研究從基因突變的角度出發(fā)，利用紫外和亞硝酸鈉（NaNO2）設計單因素和正交試驗獲得復合誘變的最佳條件，選育得到遺傳性狀穩(wěn)定的高產纖維素酶突變株，為高產纖維素酶菌種在綠色、環(huán)保農業(yè)中的開發(fā)尊定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）：本實驗室從酒醅中篩選得到。

1.1.2 化學試劑

羧甲基纖維素鈉、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、硫酸銨、氯化鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖（生化試劑）、磷酸二氫胺、硫酸鎂（均為分析純）：重慶川東化工集團有限公司；纖維素粉（生化試劑）、纖維素酶（10 000 U/mL）：寧夏和氏璧生物技術有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基[14-15]

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20min。

PDA固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入15～20 g瓊脂粉。

羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethylcellulose，CMCNa）培養(yǎng)基：KH2PO41g，（NH4）2SO41g，MgSO4·7H2O 0.15 g，CMC-Na 15 g，酵母粉1 g，瓊脂20 g，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

剛果紅培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g/L、（NH4）2SO42 g/L、瓊脂18 g、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、纖維素粉1.88 g/L、剛果紅0.2 g/L，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，（NH4）2SO44 g，NaCl 1.25 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，瓊脂粉20 g，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

STARTER2C pH計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；YXQLS-75S11壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ME104E/02電子天平：托利多儀器（上海）有限公司；HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喬欣科學儀器有限公司；GZ-250-HS11恒溫恒濕培養(yǎng)箱：韶關市廣智科技設備有限公司；THZ-98A 恒溫振蕩器：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）接種到PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃條件下靜置恒溫培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 菌懸液的制備

將活化的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.3 生長曲線和酶活力曲線的繪制

將菌液接種至50 mL/250 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，采用光電比濁法測定原始菌株的生長曲線[9]；菌株在28 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24 h，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，取上清液，即為粗酶液，每4 h在波長600 nm條件下測定吸光度值（OD600nm值），并用DNS法測定CMC酶活[16]，繪制貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）生長曲線和酶活力曲線。

纖維素酶活的測定[17]：取0.5 mL粗酶液，加入1.5 mL 1%CMC緩沖液，50 ℃水浴30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，迅速冷卻后定容至10 mL。對照組加0.5 mL滅活的粗酶液代替粗酶液，其他條件不變，于540 nm波長條件下測定OD540nm值。

纖維素酶活定義[18]：將每分鐘由羧甲基纖維素鈉水解成1.0 μg葡萄糖所需的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 復合誘變

（1）紫外誘變

用無菌水將培養(yǎng)好的菌液梯度稀釋，取10-6梯度5 mL菌懸液于培養(yǎng)皿中；在暗室中先將紫外預熱20 min，再將培養(yǎng)皿置于紫外燈20 cm處分別照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s后4 ℃冷藏2 h。避光條件下取60 μL菌液涂布于PDA固體培養(yǎng)基上，避光、28 ℃條件下靜置培養(yǎng)2～3 d，計算不同紫外誘變時間對原始菌株的致死率，其計算公式如下：

（2）亞硝酸鈉（NaNO2）誘變

將紫外誘變選出的菌種制成菌液進行NaNO2誘變，將誘變后的菌液稀釋涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，與空白組對照計算致死率。

1.3.5 復合誘變條件優(yōu)化

（1）單因素試驗

NaNO2誘變時間：將1mL菌液加入1mL0.2mol/LNaNO2中，再加入1 mL pH 4.4醋酸緩沖液，28 ℃水浴，反應5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后加入2 mL pH 8.6 Na2HPO4緩沖液，考察誘變時間對纖維素酶酶活的影響。

在此基礎上依次考察NaNO2誘變溫度（20℃、25℃、30℃、35 ℃、40 ℃）、NaNO2濃度（0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L）對纖維素酶酶活的影響。

（2）正交試驗

由于復合誘變是多因素相互作用對誘變效果影響較大，因此以單因素試驗結果為依據，采用L9（33）正交設計試驗，對影響致死率的幾個因素進行設計，即以誘變溫度（A）、誘變時間（B）和NaNO2濃度（C）為試驗影響因素，以致死率為評價指標，正交試驗因素與水平見表1。

表1 復合誘變條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for complex mutagenesis conditions optimization

1.3.6 高產纖維素酶菌株的篩選

初篩：將復合誘變后的菌株接種到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)48 h。選取在培養(yǎng)基上長勢好的菌株進行復篩。

復篩：選取在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上長勢較好的單菌落點接到PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取水解圈直徑（D）/菌落直徑（d）值大的菌株測定其纖維素酶酶活。

1.3.7 遺傳穩(wěn)定性試驗

將復合誘變后纖維素酶活最高的突變株轉接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代。用DNS法測定隔代之間的酶活變化，考察誘變后菌株的穩(wěn)定性。

1.3.8 數(shù)據處理與分析

采用SPSS19.0數(shù)據處理系統(tǒng)對正交試驗數(shù)據進行一般線性模型分析，采用Origin 7.5進行圖表的繪制。試驗數(shù)據表示為“平均值±標準誤差”（n=3）。

2 結果與分析

2.1 生物量和酶活力曲線

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）生長曲線和酶活力曲線，結果見圖1。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌生長曲線和酶活力曲線Fig. 1 Growth curve and enzyme activity curve of Bacillus velezensis

由圖1可知，貝萊斯芽孢桿菌在經過短暫遲緩期后，在前16 h處于對數(shù)期，菌體濃度增加速率快，16 h后進入穩(wěn)定期，菌體濃度增長緩慢，24 h后菌種進入衰亡期，生長緩慢菌體濃度幾乎保持不變。菌株在培養(yǎng)24 h之前，纖維素酶活隨培養(yǎng)時間而增大；在培養(yǎng)24 h時纖維素酶活達到最高，達到49.31 U/mL；培養(yǎng)24 h后由于發(fā)酵液中底物消耗較多和產物的反饋抑制，酶活緩慢下降一段后達到平衡。因此，選擇培養(yǎng)24 h的菌株作為出發(fā)菌進行紫外誘變。

2.2 紫外誘變

通過紫外對原始菌株進行誘變處理，根據不同紫外誘變時間的致死率，優(yōu)化紫外處理時間，試驗結果見圖2。

由圖2可知，對貝萊斯芽孢桿菌出發(fā)菌進行紫外誘變時，隨著誘變時間的增加，菌株的致死率也隨之增加。當紫外照射時間為150 s時，菌株的致死率達到85.4%，滿足菌株正突變率最高的致死率范圍（80%～90%）[20]，此時誘變效果最佳。所以選擇紫外誘變時間為150 s。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌紫外誘變致死率Fig. 2 Lethality rate of Bacillus velezensis by ultraviolet mutagenesis

2.3 復合誘變條件優(yōu)化單因素試驗

2.3.1 不同NaNO2誘變時間對致死率的影響

用NaNO2對菌株進行誘變時，處理時間不同菌株基因發(fā)生突變的概率有差異，本研究在室溫條件下用濃度為0.2 mol/L的NaNO2，根據不同誘變時間對菌種的致死率，選擇最優(yōu)范圍進行正交試驗，結果見圖3。

圖3 不同NaNO2誘變時間對菌株致死率的影響Fig. 3 Effect of different NaNO2 mutagenesis time on lethality rate of strains

由圖3可知，隨著NaNO2處理時間的增長，菌種的致死率增加，說明NaNO2處理對菌種有明顯的致死性，菌株對NaNO2較敏感。當NaNO2誘變時間為25 min時，菌種的致死率達到90.1%。因此，選擇NaNO2最佳誘變時間為25 min。

2.3.2 不同NaNO2誘變溫度對致死率影響

對菌株進行誘變時，溫度對誘變劑的誘變效果有一定影響，本研究通過用0.2 mol/L的NaNO2在不同溫度下誘變處理菌種25 min，根據致死率優(yōu)化NaNO2誘變溫度，結果見圖4。

由圖4可知，在20～45 ℃范圍內NaNO2對菌種進行誘變時，致死率隨溫度增加而增加。當溫度在25～35 ℃時，溫度處于細菌生長的最適溫度范圍，此時菌株對NaNO2較敏感，因此致死率增加最快。當誘變溫度為25 ℃時，菌種致死率達到85.0%。當溫度超過40℃，菌種受到高溫和誘變劑的影響，致死率＞97%。因此，選擇NaNO2最佳誘變溫度為25 ℃。

圖4 不同NaNO2誘變溫度對菌株致死率的影響Fig. 4 Effect of different NaNO2 mutagenesis temperature on lethality rate of strains

2.3.3 不同NaNO2濃度對致死率的影響

用NaNO2對菌株進行誘變，在25 ℃條件下用不同濃度NaNO2誘變處理25 min，根據致死率優(yōu)化NaNO2誘變濃度，結果見圖5。

圖5 不同NaNO2濃度對菌株致死率的影響Fig. 5 Effect of different NaNO2 concentration on lethality rate of strains

由圖5可知，菌種對NaNO2誘變敏感，在NaNO2濃度為0.1 mol/L時致死率達到70.8%。隨NaNO2的濃度上升，菌種致死率持續(xù)升高，當NaNO2濃度為0.2 mol/L時，致死率達到87.8%。NaNO2濃度＞0.4 mol/L后，受高濃度NaNO2的作用菌種幾乎全部失活。因此，選擇NaNO2最佳誘變濃度為0.2 mol/L。

2.3.4 復合誘變條件優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗基礎上，采用L9（33）正交試驗設計，選擇誘變溫度（A）、誘變時間（B）和NaNO2濃度（C）為試驗影響因素，以致死率為評價指標進行正交試驗，正交試驗結果與分析見表2。

表2 復合誘變條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests for complex mutagenesis conditions optimization

由表2可知，由極差R得到誘變溫度、時間和NaNO2濃度對致死率影響順序為C＞B＞A，說明NaNO2濃度對致死率影響最大，對致死率影響最小的因素是誘變溫度，由正交試驗結果分析得到最佳NaNO2誘變條件組合為A1B1C1，即誘變溫度23 ℃、誘變時間23 min、NaNO2濃度0.25 mol/L。在此優(yōu)化復合誘變條件下，進行3次平行驗證試驗，致死率達到83.8%，與正交分析結果相符合，說明NaNO2最佳誘變條件組合為A1B1C1。

2.4 高產纖維素酶突變株篩選

按最優(yōu)復合誘變條件對原始菌株進行誘變后，用DNS法測定突變菌株纖維素酶活并與原始菌株酶活比較，結果見表3。誘變菌株在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用剛果紅溶液對長勢較好的菌落進行染色，根據水解圈大小和菌圈大小比值（D/d值）選擇比值大的菌株，突變菌株的D/d值見圖6。

由表3可知，經復合誘變篩選出的菌株均有纖維素酶活，其中突變株UN-2酶活提高最少，僅提高到原始酶活的126.3%，突變株UN-5纖維素酶活提高最明顯，比原始菌株酶活提高了205.8%。

表3 突變菌株酶活與原始菌株酶活比較Table 3 Enzyme activity ratio of mutant strain and original strain

圖6 復合突變菌株D/d值和酶活測定結果Fig. 6 Determination results of D/d values and enzyme activities of complex mutagenesis strains

由圖6可知，剛果紅染色中水解圈和菌落比大的酶活也相對較高，其中菌株UN-5的纖維素酶酶活最高，達到101.48 U/mL，比原始菌株酶活提高了205.8%，說明經UVNaNO2復合誘變，原始菌株貝萊斯芽孢桿菌的突變菌株產纖維素酶能力增強。

2.5 遺傳穩(wěn)定性

將復合誘變后篩選出的突變株UN-5接種至CMC-Na培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代10代，用DNS法測定每代的纖維素酶酶活，結果見表4。

由表4可知，突變株UN-5連續(xù)傳代10代后纖維素酶活仍然達到100.5 U/mL。與第一代相比，纖維素酶活稍有降低，酶活降低1 U/mL，變化率為1%，變化幅度不顯著，連續(xù)傳代對突變株UN-5酶活雖然有一定影響，但變化很小，傳代10代后酶活仍有99.0%。說明該突變株遺傳性狀穩(wěn)定，可進一步應用到實際生產中。

表4 突變菌株UN-5遺傳穩(wěn)定性Table 4 Genetic stability of mutant strain UN-5

3 結論

本研究以貝萊斯芽孢桿菌為出發(fā)菌，確定菌種在培養(yǎng)12 h時到達對數(shù)期，菌株原始酶活為49.31 U/mL；用紫外對菌株誘變150 s時，菌株致死率達到85.4%。經單因素和正交試驗優(yōu)化誘變條件，得到NaNO2誘變的最佳條件：23 ℃條件下0.25 mol/L的NaNO2誘變處理23 min。按最優(yōu)誘變條件對原始菌株進行紫外-NaNO2復合誘變處理，突變株UN-5纖維素酶產量最高，其酶活達到101.5 U/mL，比原始菌株的酶活提高了205.8%。突變株UN-5連續(xù)傳代10代后酶活仍有99.0%，遺傳性能穩(wěn)定，可用于生物有機肥生產。