Amy S. Li , Akims Iijim , Junho Hung ,?, Qing X. Li , Yongli Chen ,*

a College of Natural and Computational Sciences, Hawaii Pacific University, Kaneohe, HI 96744, USA

b Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa, Honolulu, HI 96822, USA c Department of Internal Medicine, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO 80045, USA

1. 引言

芳樟醇（LL）、甲基丁香酚（ME）、草蒿腦（EG）和香茅醛是從許多植物如羅勒、薰衣草、檸檬草等提取的植物精油中的主要化學(xué)成分。在傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)療法中，精油被廣泛用作鎮(zhèn)靜劑、抗驚厥藥、抗微生物藥、抗焦慮藥和局部麻醉劑[1,2]。在現(xiàn)代應(yīng)用中，我們也常常能在芳香療法產(chǎn)品[3]、調(diào)味劑[4]、香料、殺蟲劑[5,6]以及各種家用清潔劑[7]中發(fā)現(xiàn)上述化合物。羅勒精油的許多化學(xué)成分在實驗動物模型中顯示出抗驚厥活性[8]。羅勒精油在小鼠纖維肌痛模型中也表現(xiàn)出了鎮(zhèn)痛作用[9]。此外，LL（許多精油尤其是羅勒精油的主要成分）在戊四氮、苦毒素以及最大電休克發(fā)作模型中均有效[10,11]，并在小鼠模型中顯示出鎮(zhèn)靜作用[12]。此前的研究發(fā)現(xiàn)，這些特性與γ-氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng)、膽堿能系統(tǒng)、多巴胺能系統(tǒng)、谷氨酸能系統(tǒng)、5-羥色胺能系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)[6,8,13-16]。然而，這些化學(xué)成分，包括LL、ME、EG和香茅醛的分子作用機制尚不清楚。

γ-氨基丁酸A型受體（GABAAR）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中主要抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)受體。GABAAR屬于cys-環(huán)配體門控離子通道家族，煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）亦屬于此類，它是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體。許多研究表明，GABAAR在癲癇病和其他多種神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用。許多臨床處方藥（諸如苯二氮卓類藥物）均能增強GABAAR的抑制功能。有趣的是，某些抗驚厥藥物對GABAAR的增強作用與藥物的抗驚厥作用沒有太大的相關(guān)性，其中一些藥物對Nav1.2電壓門控鈉離子（Na+）通道有抑制作用[17,18]。此外，據(jù)報道，一種叫做拉莫三嗪的抗驚厥藥物除了阻斷電壓門控Na+通道[20]外，還可以有效地抑制nAChR [19]。因此，鑒于羅勒精油已經(jīng)被廣泛用作鎮(zhèn)靜劑、抗驚厥藥、生物農(nóng)藥和食品防腐劑[5,21]，為了進一步闡明羅勒精油中主要的單萜成分（圖1）的分子作用機制，本文將著手研究這些單萜成分對nAChR和GABAAR的電生理作用。

2. 材料和方法

2.1. 化學(xué)藥品

實驗所用的所有的化學(xué)藥品：包括GABA、(-)-LL、ME、EG、(R)-香茅醛[(R)-C]和(S)-香茅醛[(S)-C]，以及戊四氮（PTZ），除非另作說明，均購自西格瑪奧德里奇公司（位于美國密蘇里州圣路易斯）。

2.2. 細胞培養(yǎng)

試驗所用細胞為分別能夠穩(wěn)定地表達小鼠α1β3γ2L GABAAR [22,23]和小鼠α3β4 nAChR亞型[24]的WSS-1細胞系（ATCC; CRL-2029TM）以及KXα3β4R2細胞系（喬治敦大學(xué)Yingxian Xiao博士慷慨饋贈）。這兩株細胞系均置于GlutaMAXTM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific公司，美國沃爾瑟姆）中并在37 ℃和5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。此外，在上述培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清、0.4 mg·mL-1G-418、100單位·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1鏈霉素。每周進行兩次傳代培養(yǎng)，采用1∶5的稀釋比，融合率為75%～90%。這些細胞在組織培養(yǎng)板中培育之后的24～72 h之間被用于全細胞電流記錄。

圖1. (-)-LL（a）、ME（b）、EG（c）和香茅醛（d）的結(jié)構(gòu)。

2.3. 全細胞電流記錄

使用計算機控制的膜片鉗放大器（EPC 10 USB）和內(nèi)置數(shù)字化儀（LIH 8+8）（HEKA Elektronik公司，美國馬薩諸塞州霍利斯頓）放大全細胞電流，并使用數(shù)據(jù)采集軟件PatchMaster（HEKA Elektronik公司）進行記錄。使用Narishige PC-10垂直拔管器（Narishige International USA公司，美國紐約州Amityville）從硼硅酸鹽玻璃毛細管（World Precision Instruments公司，美國佛羅里達州薩拉索塔）中抽出2～3 MΩ的記錄毛細管。細胞內(nèi)電極緩沖液由140 mmol·L-1CsCl、10 mmol·L-1乙二醇四乙酸（EGTA）、2 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1四乙基氯化銨（TEA-Cl），以及10 mmol·L-14-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）組成，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.4。當使用KXα3β4R2細胞系（表達nAChR）時，上述細胞內(nèi)緩沖液中不添加TEA-Cl。細胞外電極緩沖液由145 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1KCl、2 mmol·L-1CaCl2、1.5 mmol·L-1MgCl2和25 mmol·L-1HEPES組成，并用NaOH調(diào)節(jié)至pH = 7.4。接觸細胞的膜片鉗設(shè)置為-60 mV。該實驗在室溫（25 ℃）環(huán)境下進行并至少重復(fù)三次。

2.4. 快速配體溶液輸送

前人的研究已經(jīng)詳細描述了用于將配體溶液快速送至細胞表面膜蛋白的細胞流動裝置[25]。綜上所述，其操作是在入口和出口管道之間連接一個中間孔直徑為150 μm的U形管，并將入口和出口管用Minipuls?3號蠕動泵（Glison公司，美國威斯康星州米德爾敦）泵送。系統(tǒng)自動觸發(fā)并控制溶液輸送的時間和長度。這種裝置允許配體溶液在細胞內(nèi)流動并在毫秒內(nèi)實現(xiàn)交換。

2.5. 曲線擬合

我們用面向Windows系統(tǒng)的GraphPad Prism軟件5.04版（GraphPad Software公司，美國加利福尼亞州圣地亞哥）對不存在LL或存在5 mmol·L-1LL兩種不同情況下的LL受體抑制曲線和GABAAR的劑量依賴性反應(yīng)曲線進行擬合。激動劑的濃度-響應(yīng)關(guān)系用方程式I/Imax= 1/[1 + (EC50/CA)nH]擬合，其中，I和Imax分別代表給定激動劑濃度（CA）下的電流和最大激動劑誘導(dǎo)電流下的電流，EC50表示半最大效應(yīng)濃度，nH為希爾系數(shù)（Hill coefficient）。戊四氮（PTZ）抑制響應(yīng)關(guān)系用方程式IA/I0= 1/[1 + (IC50/CLL)nH]擬合，其中，IA和I0分別表示LL存在以及不存在時的電流幅，IC50表示半抑制濃度，CLL是LL的濃度。數(shù)據(jù)用平均值±均值標準差（SEM）表示。

圖2. LL對100 μmol·L-1 GABA誘導(dǎo)的α1β3γ2L GABAAR（a）和3 mmol·L-1氨甲酰膽堿誘導(dǎo)的α3β4 nAChR（b）的全細胞電流的劑量依賴性抑制。小鼠α1β3γ2L GABAAR在WSS-1細胞中穩(wěn)定表達，小鼠nAChR亞型在KXα3β4R2細胞系中穩(wěn)定表達。LL對GABAAR的最大抑制作用是對照的44%和nAChR的13%。氨基甲酰膽堿是一種穩(wěn)定的乙酰膽堿類似物，被用作nAChR全細胞電流記錄的對照。

3. 結(jié)果

3.1. 芳樟醇的劑量依賴性抑制

將各種濃度的LL與接近飽和的100 μmol·L-1的GABA共同施用。與100 μmol·L-1GABA誘導(dǎo)的控制電流相比，很明顯，LL劑量依賴性地抑制α1β3γ2L GABAAR [圖2（a）]。有趣的是，當與氨甲酰膽堿聯(lián)合應(yīng)用時，LL還以與在GABAAR上相似的效力對α3β4 nAChR產(chǎn)生了抑制作用[圖2（a）、（b）]，盡管其效力似乎更強。LL對GABAAR的不完全抑制可能是由于LL在水溶液中的溶度極限所致，因為我們所能獲得的LL溶液的最高濃度只有50 mmol·L-1。nAChR的全細胞電流由接近飽和濃度的氨甲酰膽堿誘導(dǎo)，氨甲酰膽堿是內(nèi)源性激動劑乙酰膽堿的穩(wěn)定類似物。

在不存在LL或存在5 mmol·L-1LL兩種不同的情況下，GABA的劑量-反應(yīng)曲線表明，LL抑制了激動劑GABA誘導(dǎo)的全細胞電流，而激動劑親和力沒有改變（圖3）：在LL不存在以及存在的情況下，EC50值分別為(36.2 ± 7.9) μmol·L-1和(36.1 ± 23.8) μmol·L-1。因此，LL是該受體的非競爭性抑制劑。

圖3. 在表達小鼠α1β3γ2L GABAA受體的WSS-1細胞中，不存在（黑色）和存在（藍色）5 mmol·L-1 LL的兩種情況下，GABA的劑量-反應(yīng)曲線。不存在和存在LL時，EC50的值分別為(36.2 ± 7.9) μmol·L-1和(36.1 ± 23.8) μmol·L-1。CGABA：GABA的濃度。

戊巴比妥是一種被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的用于治療癲癇發(fā)作的抗驚厥類藥物，在低濃度（μmol·L-1）時可增強GABAAR的功能，但在高濃度（mmol·L-1）時可抑制GABAAR的功能[26,27]。因此，我們進一步測試了在25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、75 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、500 μmol·L-1和1000 μmol·L-1濃度下，LL對GABAAR的影響。然而，這些低濃度的LL均未對GABAAR產(chǎn)生任何影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

3.2. LL 對 GABAAR 的作用方式

戊四氮（PTZ），也稱甲硝唑（metrazol），可引起驚厥，并已用于動物模型中作為誘發(fā)癲癇的一種方式。PTZ誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型（即scMET小鼠模型）已通過諸如美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）癲癇治療篩選程序?? https://www.ninds.nih.gov/Current-Research/Focus-Research/Focus-Epilepsy/ETSP.之類的程序，現(xiàn)已用于抗驚厥藥物的常規(guī)篩選。我們想知道LL與PTZ是否作用于同一位點。結(jié)果表明，與單獨使用LL或PTZ相比，當LL與PTZ共同使用時，其對GABAAR的抑制作用顯著增加[圖4（a）]。GABAAR上的PTZ結(jié)合位點與苦毒素結(jié)合位點相重疊[28,29]。此外，LL對GABAAR的拮抗作用是可逆的[圖4（b）]。因此，LL在不同于PTZ /苦毒素的位點發(fā)揮其可逆的變構(gòu)GABAAR調(diào)節(jié)作用。

圖4.（a）與單獨使用LL或PTZ相比，將LL與PTZ共同應(yīng)用時，發(fā)現(xiàn)對小鼠α1β3γ2L GABAAR的抑制作用顯著增加。（b）分別由100 μmol·L-1 GABA（對照，黑色）、5 mmol·L-1 LL+100 μmol·L-1 GABA（紅色）誘發(fā)的代表性全細胞電流記錄，在處理1 min后僅用100 μmol·L-1 GABA（藍色）恢復(fù)到原始對照電流。

3.3. 甲基丁香酚、草蒿腦和香茅醛是GABAAR 和nAChR的弱抑制劑

ME在濃度大于100 μmol·L-1（高達10 mmol·L-1）時，是一種GABAAR的濃度依賴性直接激動劑，同時，在低濃度的GABA（30 μmol·L-1）存在時，它會敏化并增強GABA誘導(dǎo)的電流[30]，這為其抗驚厥活性提供了可能的解釋?？紤]到LL在高劑量時也會對GABAAR有抑制作用，我們進一步拓展了此研究，以評估高濃度（mmol·L-1量級）下ME的拮抗活性。顯然，高濃度（10 mmol·L-1）時，ME對GABAAR的拮抗作用較弱（圖5）。在高濃度時，EG也有類似的作用（圖5）。有趣的是，(R)-C和(S)-C對于α3β4 nAChR均呈弱抑制作用（數(shù)據(jù)未顯示）；而(R)-C似乎對GABAAR沒有作用，(S)-C對于GABAAR有較弱的抑制作用（圖5）。總之，ME、EG和(S)-C是GABAAR的弱拮抗劑，需要非常高的濃度才能使得GABA誘導(dǎo)電流產(chǎn)生變化。

4. 討論

根據(jù)目前已有數(shù)據(jù)，我們很難對EG和(R)-C/(S)-C的主要靶點做出準確論斷，盡管作用機制尚不明確，但(R)-C/(S)-C已經(jīng)在體內(nèi)表現(xiàn)出了抗驚厥和鎮(zhèn)痛作用，據(jù)推測，其作用可能是通過GABAAR調(diào)節(jié)發(fā)生的[31,32]。然而，在目前的體外研究中，EG和(S)-C對GABAAR和nAChR的拮抗作用較弱，這表明其主要的作用靶標可能位于其他位置。在低濃度下，ME表現(xiàn)為GABAAR的激動劑；在中等濃度時，又表現(xiàn)為GABAAR正變構(gòu)調(diào)節(jié)物[30]。然而，我們已經(jīng)證明高濃度時它可能是一種GABAAR的弱拮抗劑，這表明ME的作用非常復(fù)雜。

本研究的結(jié)果表明，LL是一種濃度依賴性GABAAR拮抗劑，可在GABAAR的PTZ /苦毒素位點之外調(diào)節(jié)其活性。在本研究中觀察到的LL對GABAAR的抑制作用與先前的研究結(jié)果不同，LL在細胞和小鼠模型中具有抗驚厥活性[8,33]，并對中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）、感覺神經(jīng)元[34]甚至周圍神經(jīng)具有抑制作用[35]。LL對GABAAR的抑制作用表明神經(jīng)元具有興奮性（如類癲癇活性），這或許為其作為殺蟲劑的作用機制提供了可能的解釋[5,6]。

雖然本研究的發(fā)現(xiàn)似乎與先前關(guān)于LL抗驚厥和鎮(zhèn)靜作用的研究相矛盾，但正如我們已提到的，LL具有多種靶標，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞型[11,33,36]和電壓門控的Na+和Ca2+通道[16,35]。研究還證明LL可以抑制神經(jīng)肌肉接頭處乙酰膽堿的釋放以及微型終板電流衰減的動力學(xué)[37]。我們的結(jié)果表明，LL是神經(jīng)元nAChR的有效抑制劑?？紤]到肌肉類型與神經(jīng)元nAChR之間的同源性以及許多變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的共享性[38]，這一發(fā)現(xiàn)亦不足為奇。因此，有必要對LL的主要分子作用機制做進一步研究。正如其他研究[36]所建議的，我們可以假設(shè)nAChR、NMDA受體和（或）電壓門控Na+和Ca2+通道是可能的主要靶點，特別是考慮到NMDA受體和電壓門控的Na+、K+通道是許多其他抗驚厥藥物的靶點[39]。

圖5. 10 mmol·L-1 ME分別與10 μmol·L-1 GABA和100 μmol·L-1 GABA共同施用時，對GABAAR的功能起弱抑制作用。將10 mmol·L-1 EG和10 μmol·L-1 GABA共同施用時，對GABAAR功能有抑制作用。當與40 μmol·L-1 GABA共同施用時，5 mmol·L-1 (R)-C不會抑制GABAAR誘導(dǎo)的電流；而在共同施用40 μmol·L-1 GABA的條件下，5 mmol·L-1(S)-C則會對GABAAR呈弱抑制作用。

更重要的是，CNS中這些受體之間的共定位和串擾[40,41]使得其與小分子的相互作用不同于此處所使用的簡單重組系統(tǒng)。有越來越多的證據(jù)證明興奮性和一致性的神經(jīng)遞質(zhì)受體之間存在共定位和串擾現(xiàn)象。正如已經(jīng)被人們廣泛研究的，可以通過NMDA受體的激活來增強和抑制GABAAR功能，反之亦然[42-45]。nAChR和GABAAR在大腦的許多區(qū)域也有共同定位，據(jù)報道，nAChR的激活可以阻斷GABA誘導(dǎo)的海馬間神經(jīng)元電流[46]。然而，此間的相互作用機制還沒有被我們很好地了解。

精油由多種單萜類化合物組成（包括LL、ME、EG和香茅醛）。我們可以合理地假設(shè)LL以及其他單萜類化合物以不同的效力調(diào)節(jié)多個不同的受體和通道，以達到協(xié)同效應(yīng)[5]。單萜類化合物也可能調(diào)節(jié)不同神經(jīng)遞質(zhì)受體之間的相互作用。研究中所觀察到的單萜類化合物的作用模式可以對精油成分作為鎮(zhèn)靜劑、抗驚厥劑、局部麻醉劑和殺蟲劑的使用提供一定的支持。這一結(jié)果值得進一步研究和開發(fā)作為人類治療和植物殺蟲劑的精油成分，特別是單萜類化合物對各種昆蟲神經(jīng)受體所表現(xiàn)出的選擇性，這一點在實際應(yīng)用中尤為重要。

Acknowledgements

This project was supported by grants from Bayer AG Crop Science (Grant4Targets 201701018), the National Center for Research Resources (5P20RR016467-11),and the National Institute of General Medical Sciences(P20GM103466) of the National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health and Bayer AG Crop Science.

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Amy S. Li, Akimasa Iijima, Junhao Huang, Qing X. Li,and Yongli Chen declare that they have no conflicts of interest or financial conflicts to disclose.