Franck E. Dayan *, Stephen O. Duke

a Agricultural Biology, College of Agricultural Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523, USA

b Natural Products Utilization Research, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, University, MS 38677, USA

1. 引言

具有明顯的新的分子靶標(biāo)[作用位點(diǎn)（SOA）]的商業(yè)除草劑已經(jīng)有30多年沒有被使用了[1]。在此期間，進(jìn)化出的獨(dú)特的抗除草劑雜草的數(shù)量增加了約5倍，現(xiàn)在，多種惡性雜草對(duì)幾種具有不同SOA的除草劑都產(chǎn)生了抗性[2]?？刂瞥輨┠退幮匝葑冿L(fēng)險(xiǎn)的一種方法是，將具有不同作用方式（MOA）的幾種除草劑組合使用，類似于混合藥物延遲耐藥性的演變。與抗生素和其他一些藥物（如抗癌藥）一樣，我們迫切需要一種具有新SOA的化合物用于耐藥性管理。

不幸的是，由于抗草甘膦作物的巨大成功以及由此導(dǎo)致的除草劑市場(chǎng)價(jià)值下降，在20世紀(jì)90年代中期，農(nóng)藥化學(xué)工業(yè)減少了在除草劑發(fā)現(xiàn)方面的投資[1]。參與除草劑發(fā)現(xiàn)的公司的迅速合并[3]也導(dǎo)致除草劑發(fā)現(xiàn)方面總體投資的下降。發(fā)現(xiàn)具有新SOA的除草劑的迫切需求激發(fā)了人們對(duì)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的方法的研究興趣。過(guò)去，除草劑的發(fā)現(xiàn)一直依賴于通過(guò)大型化學(xué)庫(kù)的合成和評(píng)估來(lái)識(shí)別具有良好除草活性的先導(dǎo)化合物（高通量篩選）。另一種方法是優(yōu)化具有新型分子靶標(biāo)的中等活性化合物的結(jié)構(gòu)，以期能開發(fā)出分子靶標(biāo)不變但可增強(qiáng)靶位點(diǎn)活性和可用于農(nóng)業(yè)的商品。如三苯酮類除草劑，該除草劑是通過(guò)優(yōu)化化感物質(zhì)纖精酮（allelochemical leptospermone）的結(jié)構(gòu)而得到的[4]。纖精酮和這類商業(yè)除草劑類似物可抑制二羥苯基丙酮酸雙加氧酶（HPPD）的活性[5]，HPPD是最新引入的除草劑SOA。許多其他具有新型分子靶標(biāo)的天然植物毒素可作為發(fā)現(xiàn)除草劑的起始模板[6]。但是，到目前為止，還沒有人通過(guò)這種方法生產(chǎn)出具有新SOA的商業(yè)除草劑。同樣地，對(duì)與潛在除草劑靶標(biāo)酶結(jié)合的小分子進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬（生物理性設(shè)計(jì)），以及使用潛在靶標(biāo)酶的體外實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選大型組合化學(xué)庫(kù)，也未能得到具有新作用靶位點(diǎn)的商業(yè)化產(chǎn)品。最后，使用基因敲除技術(shù)尋找通過(guò)新的作用靶位點(diǎn)已經(jīng)識(shí)別出的潛在的新的除草劑靶標(biāo)（參考文獻(xiàn)[7]中有詳細(xì)討論），但并未找到這些靶標(biāo)的有良好除草活性的分子。這種方法存在的一個(gè)問(wèn)題是，敲除突變體通常會(huì)完全消除靶標(biāo)酶的活性，而化學(xué)物質(zhì)很少能100%抑制該酶的活性。因此，用基因敲除獲得的致死表型不會(huì)轉(zhuǎn)化為除草活性，而會(huì)通過(guò)化學(xué)作用部分抑制靶標(biāo)的活性。為了更好地評(píng)估除草劑的SOA，我們需要一種基因敲除的校正方法。

雖然人們對(duì)發(fā)現(xiàn)具有新SOA的除草劑的方法有著濃厚的興趣，但很少有論文為此類發(fā)現(xiàn)提供新的策略和見解。一個(gè)例外是，使用基因組學(xué)方法，從編碼天然植物毒素生物合成途徑的酶的基因簇中，發(fā)現(xiàn)植物毒素的靶標(biāo)酶（如參考文獻(xiàn)[8]）。能夠產(chǎn)生抑制初級(jí)代謝酶的毒素的微生物，通常在毒素合成的基因簇中具有抗性基因[9]。在某些情況下，抗性基因編碼了毒素靶標(biāo)的突變型抗性形式。因此，研究微生物植物毒素有可能發(fā)現(xiàn)新的潛在除草劑及其SOA。這種方法是有前途的，但未經(jīng)證實(shí)。例如，盡管通過(guò)這種方法發(fā)現(xiàn)了支鏈氨基酸合成途徑酶-二羥基酸脫水酶（DHAD）的微生物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物抑制劑（天冬氨酸），但該抑制劑是酶的弱抑制劑和弱除草劑[10]。盡管DHAD在一段時(shí)間內(nèi)一直被認(rèn)為是潛在的除草劑SOA（如參考文獻(xiàn)[9]中的討論），但目前還沒有出現(xiàn)抑制DHAD的商業(yè)除草劑。

圖1. 本文討論了兩種新的用于識(shí)別除草劑靶標(biāo)的潛在方法。第一種是識(shí)別被抑制后引起植物毒性代謝產(chǎn)物積累的酶（左），第二種是識(shí)別植物組織中低分子濃度的靶位點(diǎn)（右）。

本文討論了兩種新的除草劑靶標(biāo)識(shí)別方法。第一種是識(shí)別被抑制后引起植物毒性代謝產(chǎn)物積累的酶（圖1），第二種是鑒定植物組織中低分子濃度的靶位點(diǎn)（圖1）。這兩種方法都可能會(huì)識(shí)別出能夠響應(yīng)低劑量除草劑的靶位點(diǎn)。從環(huán)境和毒理學(xué)的角度來(lái)看，低劑量是可取的，而且如果一個(gè)化合物分子的生產(chǎn)成本昂貴，低劑量的特性可以使其作為除草劑在經(jīng)濟(jì)上可行。

2. 初級(jí)代謝酶的毒性前體

大多數(shù)商業(yè)除草劑在雜草中只有一個(gè)主要的分子靶位點(diǎn)。在某些情況下，除草劑以同一類型酶的幾種變體為靶標(biāo)，如含有絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑內(nèi)毒素和抑制長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酶的除草劑。這些靶標(biāo)幾乎都是初級(jí)代謝的酶。非酶靶標(biāo)的除草劑包括光合系統(tǒng)II的光合電子流抑制劑（如阿特拉津和敵草隆）、光合系統(tǒng)I的能量轉(zhuǎn)移劑（如百草枯和敵草快）以及與非酶蛋白F-box蛋白結(jié)合的生長(zhǎng)素類除草劑[如2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）]，F(xiàn)-box蛋白可以介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)。

通過(guò)抑制酶阻斷初級(jí)代謝途徑通常是致命的，但是，用化學(xué)制劑完全阻斷代謝途徑又很困難。除阻斷部分代謝途徑外，植物毒性化合物的積累還應(yīng)提高除草劑的藥效。一些非常成功的除草劑和一些天然植物毒素發(fā)揮作用的主要原因是植物性毒性的中間代謝產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的衍生物的積累（圖1）。最明顯的例子是原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑（表1）[11]。PPO抑制劑類除草劑種類相對(duì)較多。PPO是一種存在于線粒體和質(zhì)體（如葉綠體）中的酶，參與生產(chǎn)血紅素和葉綠素所需的卟啉的生物合成。盡管這類抑制劑抑制了PPO，但它們會(huì)導(dǎo)致PPO的酶促產(chǎn)物原卟啉IX（PPIX）的積累。在光和分子氧存在的情況下，PPIX有劇毒，因?yàn)樵谶@種條件下，PPIX充當(dāng)一種光敏色素，并生成單線態(tài)氧，進(jìn)而產(chǎn)生其他活性氧（ROS）。當(dāng)PPO被抑制時(shí)，其前體原卟啉原IX會(huì)積累并退出卟啉途徑，通過(guò)PPO以外的方式在對(duì)細(xì)胞中單線態(tài)氧和其他ROS防護(hù)相對(duì)較弱的位置上被氧化成PPIX。正常情況下，PPIX和其他卟啉途徑中間體的濃度非常低，并且僅限于線粒體和質(zhì)體中的卟啉途徑，這些地方較好地防護(hù)了ROS，尤其是在葉綠體中。這種作用方式的優(yōu)點(diǎn)是，致命的ROS水平可能是通過(guò)抑制植物中部分PPO的活性而產(chǎn)生的。最有效的PPO抑制劑是一些活性最強(qiáng)且施用量最低（每公頃幾克）的除草劑。在致死劑量下，所有除草劑都會(huì)產(chǎn)生ROS，這是嚴(yán)重生化和生理破壞的三級(jí)作用。而ROS會(huì)進(jìn)一步破壞植物的生理和生化特性。有許多文章誤以為這種普遍的三級(jí)作用是初級(jí)作用。使用PPO抑制劑時(shí)，ROS的產(chǎn)生更接近于PPO抑制的主要產(chǎn)物。

乙酰乳酸合酶（ALS）抑制劑是一大類除草劑（表 1）。ALS是支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）合成途徑中的第一個(gè)酶。從理論上講，如果ALS抑制劑的作用完全取決于支鏈氨基酸的消耗，則該合成途徑中其他兩種酶的任意一種都可以作為除草劑的靶標(biāo)。然而，有許多來(lái)自不同化學(xué)類別的商用抗ALS除草劑，并沒有以該合成途徑中其他兩種酶作為靶標(biāo)。酮酸還原異構(gòu)酶（KARI）和DHAD（該合成途徑中的第二種酶和第三種酶）的良好體外抑制劑已被發(fā)現(xiàn)[12-14]。但是，利用KARI和DHAD抑制劑開發(fā)商業(yè)除草劑的研究一直都沒有成功。這三種酶之間的一個(gè)區(qū)別是，只有ALS底物a-酮丁酸酯（2KB）具有植物毒性。2KB可以通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用被轉(zhuǎn)化為對(duì)植物有毒的2-氨基丁酸酯（2-AB），而2KB和2AB在用ALS抑制劑處理的高等植物中積累[15]。盡管Shaner和Singh [16]認(rèn)為，由于2AB與ALS抑制劑的除草作用之間沒有良好的相關(guān)性，缺乏良好的相關(guān)性并不能排除它們沒有參與作用的可能性。在同一篇論文中，他們表明，用高濃度纈氨酸處理玉米幼苗會(huì)抑制幼苗生長(zhǎng)和2AB的積累。2AB的植物毒性可能導(dǎo)致這一生長(zhǎng)抑制。他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏良好相關(guān)性，這可能是由于參與植物毒性的2AB庫(kù)的細(xì)胞定位的混淆效應(yīng)。ALS抑制劑也會(huì)導(dǎo)致奎寧酸鹽（一種來(lái)自莽草酸途徑的植物毒素）的積累，如參考文獻(xiàn)[17]所述。ALS如何導(dǎo)致奎寧酸鹽的積累尚不清楚。與大多數(shù)商業(yè)除草劑相比，最好的ALS抑制劑可以在極低的劑量下有效地除草。

AAL（Alternaria alternataf. sp.lycopersici）毒素是一種天然的植物毒素，它可以在極低的劑量下起效。通過(guò)抑制神經(jīng)酰胺合酶（植物中的CS或鞘氨醇N-?；D(zhuǎn)移酶），它可以導(dǎo)致鞘氨醇基CS前體鞘氨醇類和4-羥基鞘氨醇迅速而高水平地積累（表1）[18]。即使在亞微摩爾濃度下，該作用也非常迅速和強(qiáng)烈。此外，外源供應(yīng)的CS前體會(huì)引起與AAL毒素類似的植物毒性癥狀[19]，這表明前體的積累是膜功能迅速喪失的原因，而不是由神經(jīng)酰胺合成所引起的。健康植物組織中CS前體的含量非常低，但是神經(jīng)酰胺及其糖基化形式是植物質(zhì)膜的重要組成部分[20]。游離鞘脂堿基能夠迅速破壞質(zhì)膜的完整性[19]，這可能是由于這些化合物對(duì)質(zhì)膜完整性有直接影響，而其他機(jī)制對(duì)其有間接影響。AAL毒素和其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的CS抑制劑（如伏馬菌素）對(duì)CS前體的積累也有類似的作用[21]。盡管許多人已經(jīng)將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡看作AAL毒素的MOA（如參考文獻(xiàn)[22]），但與AAL毒素對(duì)CS前體的作用相比，這些作用顯然是毒素對(duì)CS的次級(jí)或三級(jí)作用，正如植物中與百草枯毒性相關(guān)的細(xì)胞凋亡顯然是除草劑的二級(jí)作用一樣[23]。在陽(yáng)光充足的情況下，大量ROS的產(chǎn)生會(huì)迅速破壞質(zhì)膜，因此百草枯導(dǎo)致的細(xì)胞死亡速度很快，細(xì)胞無(wú)法參與凋亡過(guò)程。

草銨膦（glufosinate）是一種廣譜的非選擇性除草劑，可使植物迅速死亡（接觸活性）。草銨膦是D-和L-磷脂酰絲菌素的外消旋混合物。L-磷脂酰絲菌素是潮鏈霉菌（Streptomyces hygroscopus）的天然產(chǎn)物，該對(duì)映異構(gòu)體是草銨膦的唯一活性成分。它被用于非農(nóng)作物區(qū)和抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物中的雜草管理。它可以抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，GS是一種存在于植物葉片中的高豐度酶，草銨膦在植物氮同化中起著至關(guān)重要的作用（表1）[24]。同源異構(gòu)體GS1位于細(xì)胞質(zhì)中，而同源異構(gòu)體GS2存在于葉綠體中[25]。GS2將光呼吸產(chǎn)生的氨同化為谷氨酰胺[26,27]。盡管已有幾種已知的GS抑制劑（大多數(shù)是由微生物產(chǎn)生的化合物），但草銨膦是唯一一種被開發(fā)成商業(yè)除草劑的分子[6]。

表1 涉及有毒前體積累和（或）低濃度靶位點(diǎn)（SOA）的除草劑MOA

草銨膦不可逆地與GS結(jié)合，導(dǎo)致由光呼吸途徑產(chǎn)生的氨積累。雖然草銨膦的作用機(jī)理與其對(duì)光呼吸途徑的改變有關(guān)，但是草銨膦的毒性與氨的積累并沒有直接的關(guān)系，而是與ROS迅速積累及隨后的脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)[28]。ROS的來(lái)源尚不清楚，但可能與用該除草劑處理過(guò)的敏感植物中觀察到的碳同化抑制有關(guān)。這種抑制可能是由于光呼吸途徑中某些中間體（磷酸乙醇酸、乙醇酸和乙醛酸）的積累所致。其中有一些中間體是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（又稱RUBP羧化酶或Rubisco）的強(qiáng)抑制劑[29,30]，因此可以被認(rèn)為是天然植物毒素。

草甘膦（glyphosate）是世界上使用最多的除草劑[31]。它只有一種SOA，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSPS）合酶，但是目前關(guān)于通過(guò)對(duì)EPSPS合酶的抑制來(lái)殺死植物的作用機(jī)理仍不完全清楚（表1）[32]。EPSPS合酶是莽草酸合成途徑的一種酶，該合成途徑負(fù)責(zé)產(chǎn)生芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。大多數(shù)植物中都含有極低水平的莽草酸-3-磷酸酯（EPSPS的底物）和莽草酸酯（EPSPS合酶的底物），但是在用草甘膦處理過(guò)的植物中有大量莽草酸酯積累，而奎寧酸鹽含量較低[莽草酸途徑的中間體（3-脫氫奎寧酸酯）的另一種產(chǎn)物]。奎寧酸鹽水解酶與莽草酸酯作用生成奎寧酸鹽[33]。有趣的是，ALS抑制類除草劑（參見上文）也會(huì)導(dǎo)致奎寧酸鹽的積累[17]。通過(guò)任何抗性機(jī)制對(duì)草甘膦產(chǎn)生抗性的植物，不會(huì)積累莽草酸酯，因此測(cè)量草甘膦對(duì)莽草酸酯的反應(yīng)是一種檢測(cè)草甘膦抗性的快速生物測(cè)定方法[34]。我們尚未發(fā)現(xiàn)莽草酸酯的植物毒性數(shù)據(jù)，但奎寧酸鹽具有中等植物毒性，可能會(huì)引起類似ALS抑制劑和草甘膦的作用[17,35,36]?？鼘幩猁}的某些作用，如對(duì)碳水化合物代謝的作用與草甘膦的作用類似[35]。因此，草甘膦的除草作用至少有一部分可能是由于高水平的奎寧酸鹽。

雖然在大多數(shù)植物組織中，莽草酸酯和奎寧酸鹽的含量都非常低，但是仍有少數(shù)植物種類積累了大量的莽草酸酯[如八角茴香（Illicium verum）和甜菊（Liquidamber styraciflua）] [37,38]和奎寧酸鹽[如金雞（Chinchona officianalis）] [39]。我們假設(shè)這類植物能夠?qū)⑦@些化合物與正常生長(zhǎng)發(fā)育所涉及的細(xì)胞分開，以避免自毒，正如許多其他會(huì)導(dǎo)致植物自毒作用的化合物那樣[40]。

許多年前，Cornish-Brown [41]預(yù)測(cè)，由于代謝中間體的大量積累，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用生效的農(nóng)藥可能特別有效。如果中間體對(duì)靶標(biāo)生物有毒，那么這種效果將被放大。草甘膦是商業(yè)上唯一已知的非競(jìng)爭(zhēng)性（不與莽草酸酯競(jìng)爭(zhēng)）酶抑制劑類除草劑，它會(huì)導(dǎo)致兩種中間體的大量積累。因此，抑制合成具有植物毒性前體的酶的非競(jìng)爭(zhēng)性酶抑制劑類除草劑可能特別有效。

次級(jí)代謝中會(huì)產(chǎn)生許多植物毒性代謝產(chǎn)物，但產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物的酶不太可能成為良好的除草劑靶標(biāo)。原因有以下幾個(gè)方面。首先，次級(jí)代謝產(chǎn)物毒性很大，必須將它們分隔開或排泄出去，避免自毒作用。例如，在腺毛表皮下的空間中將高植物毒性的青蒿素分隔開以遠(yuǎn)離細(xì)胞質(zhì)[40,42]。液泡中有一些具有植物毒性的化合物，這些化合物不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，如被儲(chǔ)存在植物液泡中的具有植物毒性的芥子油苷[43]?；形镔|(zhì)高粱酮（allelochemical sorgoleone）的對(duì)苯二酚前體被高粱（Sorghum）的根毛分泌到土壤中，在土壤中被氧化為對(duì)植物有毒的醌高粱酮（quinone sorgoleone）[44]。這些次級(jí)化合物通常位于生物合成途徑的末端，因此它們不是通過(guò)抑制酶而積累的底物。另一個(gè)問(wèn)題是，能產(chǎn)生最具植物毒性的次生代謝產(chǎn)物的植物物種非常有限，其中大多數(shù)不太可能成為目標(biāo)雜草。一個(gè)極端的例子是青蒿素，它僅由一種非常少量的雜草黃花蒿（Artemisia annua）產(chǎn)生[42]。次級(jí)化合物幾乎可以被認(rèn)為是初級(jí)代謝產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟叩戎参镏袔缀鯚o(wú)處不在。例如，高等植物中的叔查耳酮（t-chalcone）是一種苯丙烯類化合物的前體。它是一種中度有效的植物毒素[45]，因此抑制將其用作前體的酶（查爾酮異構(gòu)酶）可能會(huì)導(dǎo)致其毒性水平上升。

另一個(gè)可能促進(jìn)植物毒性中間體產(chǎn)生的因素是，當(dāng)SOA被抑制時(shí)，代謝途徑失調(diào)。我們對(duì)這一現(xiàn)象知之甚少。有證據(jù)表明，抑制EPSPS合酶會(huì)導(dǎo)致一種或多種莽草酸途徑的產(chǎn)物濃度降低，這些產(chǎn)物負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)莽草酸途徑中碳的流入[32]。抑制ALS、CS、GS和PPO也可能會(huì)發(fā)生類似的情況。如果是這樣，有毒中間體是否達(dá)到致命水平與途徑失調(diào)的程度息息相關(guān)。

另一個(gè)要考慮的因素是有毒中間體的體內(nèi)半衰期。該化合物可能是不穩(wěn)定的，或者可能被代謝轉(zhuǎn)化為毒性更低或更高的化合物。后者的一個(gè)例子是莽草酸酯轉(zhuǎn)化為羥基苯甲酸，如原兒茶酸和沒食子酸[46]。沒食子酸是一種植物毒素[47]。

這些通過(guò)抑制酶引起有毒代謝產(chǎn)物積累的案例，只代表了該方向的小部分思路。據(jù)我們所知，目前還沒有研究對(duì)所有初級(jí)代謝產(chǎn)物的植物毒性進(jìn)行過(guò)檢驗(yàn)，更不用說(shuō)次級(jí)代謝產(chǎn)物的植物毒性了。另一種方法是檢查代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以發(fā)現(xiàn)那些在健康植物組織中的濃度非常低的化合物，因?yàn)檫M(jìn)化已使植物體內(nèi)的有毒的初級(jí)代謝中間體的積累最小化。然后通過(guò)測(cè)定這些化合物的植物毒性，以確定潛在的除草劑靶標(biāo)酶。

3. 靶標(biāo)的低濃度

另一種可行的除草劑靶標(biāo)識(shí)別方法是檢測(cè)植物中以相對(duì)較低濃度存在的靶標(biāo)（圖1）。相反，研究人員早就認(rèn)識(shí)到，大量存在的潛在靶位點(diǎn)不是好的靶位點(diǎn)，因?yàn)闉榱藲⑺乐参?，需要高劑量除草劑才能抑制足夠的靶?biāo)。例如，Rubisco是負(fù)責(zé)C3光合碳固定的酶。Rubisco是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，在C3和C4植物綠葉中分別占總蛋白質(zhì)含量的50%和30% [48]。由于其含量豐富，甚至有人提出將其作為綠葉中膳食蛋白質(zhì)的來(lái)源[49]。目前既有Rubisco的天然抑制劑也有合成抑制劑，如2-羧基阿拉伯糖醇-1-磷酸（Rubisco中間體的天然過(guò)渡態(tài)中間體）[50]和碘乙酰醇（一種合成化合物[51]），但是要抑制足夠的Rubisco并殺死雜草，需要大量施用除草劑。因此，這不是參與除草劑發(fā)現(xiàn)工作的研究人員所感興趣的靶位點(diǎn)。

通過(guò)基因擴(kuò)增靶標(biāo)（EPSPS）而造成草甘膦抗性進(jìn)化的案例證明，除草劑靶位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)除草劑是否可行至關(guān)重要。草甘膦是一種使用率很高的除草劑，在許多情況下需要約1 kg·hm?2才能有效地殺死大多數(shù)目標(biāo)雜草。草甘膦作為地球上使用最廣泛的除草劑[31]，產(chǎn)生抗藥性的選擇壓力是巨大的。已有47種雜草在剛剛過(guò)去的20年中產(chǎn)生了抗藥性，這一現(xiàn)象大約開始于草甘膦商品化的25年后[2]。植物進(jìn)化出了多種抗藥性機(jī)制[52,53]，但是最常見的機(jī)制之一是EPSPS基因的擴(kuò)增，這導(dǎo)致雜草中EPSPS合酶的濃度更高，因此需要更高劑量的草甘膦才能抑制足夠的EPSPS合酶，從而致命性地阻斷莽草酸途徑[54]。在抗草甘膦長(zhǎng)芒莧（Amaranthuspalmeri）中，EPSPS基因的拷貝增加了90倍，導(dǎo)致EPSPS蛋白質(zhì)的量增加了12倍[54]，該數(shù)量導(dǎo)致所需草甘膦的量增加了約6～8倍，這種劑量既不經(jīng)濟(jì)也不環(huán)保[54]。自第一例基因擴(kuò)增以來(lái)，在闊葉植物和草類植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種抗草甘膦的機(jī)制（如參考文獻(xiàn)[54-59]）。如果雜草中的EPSPS水平通常與那些進(jìn)化基因擴(kuò)增的除草劑目標(biāo)基因的一樣高，那么草甘膦永遠(yuǎn)不會(huì)被開發(fā)為除草劑，因?yàn)槊抗曋辽傩枰?0 kg除草劑，該劑量在經(jīng)濟(jì)和環(huán)境上都是不可行的。如果它是一種低使用率的除草劑，情況可能并非如此。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基因擴(kuò)增也是抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑的一種機(jī)制[60]。大多數(shù)抗除草劑的抗性機(jī)制，以及某些物種對(duì)某些除草劑具有天然抗性的抗性機(jī)制均尚未被查明，因此我們無(wú)法完全了解酶的豐度在許多進(jìn)化抗性和自然耐受情況下的重要程度。

同樣，對(duì)于植物中每一種主要生化途徑的酶的蛋白質(zhì)含量（無(wú)論是絕對(duì)含量還是相對(duì)含量），也幾乎沒有相關(guān)的信息。這個(gè)含量代表了潛在的除草劑結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，與草甘膦一樣，它會(huì)影響除草劑的濃度，除草劑必須到達(dá)這些酶的亞細(xì)胞位點(diǎn)才能對(duì)植物產(chǎn)生致命作用。蛋白質(zhì)組學(xué)在過(guò)去的20年中取得了巨大進(jìn)展，其在比較蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)功能、翻譯后修飾等方面提供了大量信息，但是，即使是擬南芥（Arabidopsis thaliana），我們也尚未確定其初級(jí)代謝物所涉及的所有酶中每種蛋白質(zhì)的實(shí)際相對(duì)濃度。但是，仍有一些方法可以識(shí)別植物細(xì)胞中低豐度的蛋白質(zhì)，最低可以測(cè)量2.25 fmol·mg?1的葉片鮮重的豐度（如參考文獻(xiàn)[61]）。低豐度酶比高豐度酶更有可能成為更好的潛在除草劑靶位點(diǎn)。

4. 最后的幾個(gè)觀點(diǎn)

對(duì)于這兩種可能的方法，我們有一些注意事項(xiàng)要說(shuō)明，這些注意事項(xiàng)與庫(kù)的大小或濃度不能反映庫(kù)的周轉(zhuǎn)率這一事實(shí)有關(guān)。對(duì)于利用有毒代謝產(chǎn)物的方法，當(dāng)互補(bǔ)的SOA被抑制時(shí)，較高的庫(kù)周轉(zhuǎn)率意味著化合物更快的積累，從而促進(jìn)除草劑生效。對(duì)于以酶為SOA的方法，較高的周轉(zhuǎn)率可能會(huì)降低除草劑對(duì)其作用靶位點(diǎn)的功效，因?yàn)殡S著單位時(shí)間內(nèi)酶的數(shù)量的增加，除草劑與靶標(biāo)相互作用的可能性會(huì)增加。如果除草劑是不可逆的結(jié)合劑，并且酶的降解不會(huì)釋放未改變的除草劑，這將更為重要。被抑制的酶和（或）與該酶結(jié)合的除草劑的去向會(huì)影響酶代謝庫(kù)通量速率對(duì)除草劑功效的作用。研究人員必須牢記這些注意事項(xiàng)。

為了盡快開發(fā)出新SOA的商業(yè)除草劑，我們有必要使用所有可能的發(fā)現(xiàn)方法以最大程度地提高成功的可能性。本文，我們提出了兩種概念簡(jiǎn)單的策略。代謝組學(xué)可被用于識(shí)別可能具有毒性前體的靶標(biāo)，或如果在體內(nèi)蓄積可能會(huì)轉(zhuǎn)化為毒素的前體。蛋白質(zhì)組學(xué)可被用于鑒定低豐度的酶靶標(biāo)。理想情況下，尋求被抑制時(shí)會(huì)產(chǎn)生植物毒素的低豐度SOA是最好的，如PPO（表1）。然而，情況并非總是如此，草銨膦的靶標(biāo)GS（葉片中第二大富集酶）即是例子。我們所討論的兩種方法可能已被除草劑開發(fā)公司使用過(guò)，但目前我們還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的公開記錄。

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