Goldi Mkhij , Dinesh S. Pujr , In-Hyouk Song , Byoung Hee You , Hong-Gu Kng

a Department of Engineering Technology, Texas State University, San Marcos, TX 78666, USA

b Department of Biology, Texas State University, San Marcos, TX 78666, USA

c Caresoft Global Inc., Burr Ridge, IL 60527, USA

1. 引言

由于氣候不斷變化和人口不斷增加，作物改良對糧食安全變得至關(guān)重要[1]。植物病害的防治是影響糧食安全的重要因素之一。例如，小麥作為一種主要農(nóng)作物，在過去一直受到周期性的破壞。在最近一個事件中，當(dāng)一種新的小麥莖銹病從東非蔓延到中東時(shí)，小麥價(jià)格大幅上漲，并威脅到發(fā)展中國家的生計(jì)[2]。這個例子強(qiáng)調(diào)了學(xué)習(xí)植物如何抵御潛在的病原體和害蟲以確保糧食資源的重要性。

抗性性狀的鑒定一直是植物病害防治的主要手段之一[3]。例如，一長串有效對抗植物疾病的R（抗性）基因已經(jīng)被定性并用于作物保護(hù)[4]。這些R基因會引發(fā)強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，以應(yīng)對來自各種病原體和害蟲的感染，底層信令網(wǎng)絡(luò)雖然高度復(fù)雜，但似乎涉及許多常見的參與者。例如，擬南芥（Arabidopsis）的病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（NPR1）被證明是水楊酸（SA）的受體，水楊酸是一種眾所周知的防御激素[5]，并且是大多數(shù)R基因介導(dǎo)的抗性機(jī)制所必需的[6]。因此，缺乏NPR1會導(dǎo)致不同植物物種對病原體的易感性[7]。擬南芥中的許多防御信號成分在作物植物中也起著重要的作用，這強(qiáng)調(diào)了詳細(xì)描述擬南芥抗性信號通路的重要性[8]。遺憾的是，隨著這些防御成分?jǐn)?shù)量的增加，由于缺乏價(jià)格合理的植物抗性分析的物候?qū)W工具，描述所有必要的遺傳學(xué)背景變得越來越難。

越來越多的遺傳學(xué)資源，包括自然和人工變異，為識別重要的農(nóng)業(yè)性狀提供了寶貴的機(jī)會[9]。盡管由于測序技術(shù)的進(jìn)步，大規(guī)?；蚍中同F(xiàn)在成為了常規(guī)應(yīng)用，但高通量基因分型檢測還不是常規(guī)應(yīng)用，因?yàn)闆]有固定的程序和方法，并且很少有價(jià)格合理的物候?qū)W工具[10]。在高通量設(shè)置中，植物中的抗性檢測更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)榭剐孕誀畲蠖嗍峭ㄟ^勞動密集型步驟定量感染病原體和害蟲來評估。為了克服這些障礙，我們設(shè)計(jì)了一株攜帶發(fā)光報(bào)告基因的丁香假單胞菌（P.syringae），并將其用于感染葉片的無創(chuàng)成像，以定量植物的抗性[11]。該報(bào)告菌株對100多個擬南芥生態(tài)型進(jìn)行評估，從而鑒定出兩個與擬南芥基本細(xì)菌抗性變異相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)[11]。

自動化是高通量表型的一個關(guān)鍵要素，通常由自動化工作臺完成。Phenoscope和PHENOPSIS [12,13]是兩個被用于大規(guī)模表型的商業(yè)自動化工作臺。然而，由于成本較高，這種類型的自動化工具無法被用于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室，從而使大規(guī)模研究面臨重大挑戰(zhàn)。為了克服這一障礙，我們建立了與攝像機(jī)同步的、價(jià)格合理的自動化工作臺，用于大規(guī)?；趫D像的電阻分析，這表明自動化在植物物候?qū)W領(lǐng)域中的優(yōu)勢。

2. 研究方法

2.1. 自動化工作臺的部件

自動化工作臺是使用表1和表2中列出的部件組裝的。在研究成果部分描述了一個逐步組裝的過程。

2.2. 電子倍增電荷耦合設(shè)備相機(jī)同步自動化工作臺的編程代碼

附錄A中的Supplementary data提供了一種用C++編寫的編程代碼，用于將自動化工作臺與電子倍增電荷耦合設(shè)備（EMCCD）相機(jī)同步。

2.3. 植物生長、細(xì)菌感染和細(xì)菌生長定量

擬南芥植物在22 ℃以及相對濕度60%的土壤中生長，光照時(shí)間為16 h。通過使用無針注射器在指示接種物（在10 mmol·L-1MgCl2中）上注射丁香假單胞菌，4周齡的植物被浸潤，所述接種物在28 ℃下在具有適當(dāng)抗生素的金氏B培養(yǎng)基中生長2 d。在給定的時(shí)間點(diǎn)采集接種的葉片，然后用于細(xì)菌效價(jià)測定，如前文所述[14]。

2.4. In planta NanoLuc 報(bào)告分析

使用由HCImageLive軟件（Hamamatsu, Japan）運(yùn)行的EMCCD相機(jī)（C9100-23B, Hamamatsu, Japan） 捕獲受感染植物的化學(xué)發(fā)光。外部邊緣觸發(fā)模式功能被用于同步自動化工作臺。在成像之前，植物被放置在黑暗中30 min，以減少背景發(fā)光。用NanoGlo試劑（Promega,USA）對感染的葉片進(jìn)行噴涂，并拍攝圖像；將相機(jī)設(shè)置為4倍binning，靈敏度增益為297，光子成像模式（PIM）在1 處激活，曝光時(shí)間為1 min。

3. 自動化工作臺的組裝和運(yùn)行示例

我們的自動化工作臺是為了移動傳統(tǒng)的擬南芥平面，也被稱為1020溫室托盤，它能容納18盆擬南芥植物。我們將自動化工作臺的組裝分為兩個部分：① 機(jī)械部分；② 電子部分。

3.1. 自動化工作臺的組裝——機(jī)械部分

為了支撐和移動18盆植物的重量，高剛度和高推力是自動化工作臺的必要方面。為了持續(xù)地捕捉圖像，精度也至關(guān)重要。為了達(dá)到這些要求，一個預(yù)先設(shè)計(jì)好的套件——V-Slot?NEMA 23線性執(zhí)行器束（絲杠），其SKU編號為1170批和UPC編號為819368022902——被用于提供沿x軸的自動化工作臺的平移。如圖1（a）所示，該套件有一個步進(jìn)電機(jī)、一個絲杠、螺母、墊片、軸承和一個V-Slot?龍門板。運(yùn)動由絲杠驅(qū)動，其動作由步進(jìn)電機(jī)控制。

表1 用于制造x軸組件的機(jī)械部件

表2 用于控制自動化工作臺的電子部件

平面上的每個植物都位于相機(jī)的正下方，以捕捉其圖像。這種定位需要工作臺沿x方向和y方向平移運(yùn)動。先前描述的線性執(zhí)行器束的副本被反向放置在x軸的頂部。用每個軸的V-Slot?龍門板組裝x軸和y軸，如圖1（b）所示。不能將擬南芥托盤直接放置在圖1（b）中所示的設(shè)計(jì)組件上，因?yàn)樗旧淼闹亓繒?dǎo)致相機(jī)和植物之間的偏移。因此，如圖1（c）所示，兩個V-Slot?線性軌道被安裝在組件的頂部，從而保持?jǐn)M南芥托盤在運(yùn)動過程中的穩(wěn)定和平衡。

圖1（d）展示了支撐18個擬南芥盆栽的自動化工作臺的三維實(shí)體模型。盡管土壤和水的重量相當(dāng)大（見附錄A中的Supplementary video），這個工作臺仍能夠順利地驅(qū)動植物。使用一個通用的照相臺來固定相機(jī)，其高度可以手動調(diào)整[圖1（e）]。自動化工作臺被放置在相機(jī)下面。

3.2. 自動化工作臺的組裝——電子部分

采用兩臺NEMA 23步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動自動化工作臺的x軸和y軸。一種微控制器——SainSmart計(jì)算機(jī)數(shù)控（CNC）路由器單軸3.5 A TB6560步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動板——被用于向電機(jī)提供電脈沖，且脈沖利用直流（DC）電源進(jìn)行放大。液晶顯示器（LCD）被用于指示植物在平面上的實(shí)時(shí)位置。所有組件都是電氣連接的，如圖2所示。Arduino控制器存儲操作的整個邏輯過程，用于圖像捕獲，并相應(yīng)地向步進(jìn)電機(jī)提供必要的電脈沖序列。它還在必要的時(shí)候觸發(fā)相機(jī)并控制LCD顯示工作臺的位置。

3.3. 由自動化工作臺推進(jìn)的基于圖像的抗藥性分析

我們最近開發(fā)了一種丁香假單胞菌菌株（手稿正在準(zhǔn)備中），其攜帶一種最亮的發(fā)光標(biāo)記NanoLuc螢光素酶[15]，用于植物中基于圖像的抗性檢測。為了測試自動化工作臺是否能促進(jìn)這種基于圖像的檢測，我們用發(fā)光的丁香假單胞菌對擬南芥植株進(jìn)行感染，并在它們被自動化工作臺調(diào)動時(shí)對它們進(jìn)行成像。一臺EMCCD相機(jī)連續(xù)9次不間斷地對這些受感染的植物進(jìn)行成像。值得注意的是，對已經(jīng)感染發(fā)光的丁香假單胞菌1 d、2 d和3 d的擬南芥植株進(jìn)行成像（圖3）。圖3（b）中展示了每個不同時(shí)間的具有代表性的圖片。為了確保這種基于圖像的抗性分析與常規(guī)方法一樣定量，我們繪制了兩種方法的值，如圖3（b）所示，這些值顯示出很強(qiáng)的線性相關(guān)性。這些結(jié)果表明，由自動化工作臺輔助的基于圖像的分析可以以最小的手動輸入產(chǎn)生高度定量的數(shù)據(jù)。

圖1. 帶有相機(jī)及其支架的自動化工作臺組件。放置由兩個電機(jī)控制的鋼軌來控制二維運(yùn)動。組裝第一根鋼軌（a）后，第二根鋼軌被放置在頂部（b）。安裝軌道用于支撐（c）植物生長平面（d）。（e）組裝好的工作臺被放置在EMCCD相機(jī)下。

4. 結(jié)論和觀點(diǎn)

圖2. 移動組件所涉及的各個電子元件的物理連接。

我們開發(fā)了一個可定制的自動化工作臺，能夠促進(jìn)高通量的耐藥性分析。該工作臺有兩個電機(jī)控制的T型槽金屬棒。運(yùn)動與EMCCD相機(jī)同步，允許不間斷地對植物進(jìn)行成像。結(jié)合最近開發(fā)的發(fā)光丁香假單胞菌菌株，這種自動化工具能夠在不到10 min內(nèi)對30多個受感染的擬南芥植株進(jìn)行抗性分析。如果手動進(jìn)行，同樣的抗性分析通常需要幾個小時(shí)，因?yàn)樗婕皫讉€勞動密集型步驟。

我們基于圖像的植物電阻分析使用了一個EMCCD相機(jī)，它能在昏暗的亮度下捕捉圖像。當(dāng)與自動化工作臺結(jié)合時(shí)，這種高通量友好的方法是目前為止能在最短時(shí)間（不到幾分鐘，而不是幾小時(shí)）內(nèi)進(jìn)行植物抗性分析的一種方法。除了增強(qiáng)高通量，這種較高的速度還為配備高靈敏度成像傳感器的EMCCD相機(jī)提供了額外的優(yōu)勢，即用于放大非常微弱的光信號。在被稱為增益老化的過程中，EMCCD相機(jī)的靈敏度隨著時(shí)間的推移而降低，從而導(dǎo)致傳感器靈敏度差[16]。嚴(yán)重的增益老化會使EMCCD相機(jī)無法被用于基于圖像的電阻測試，且根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，修復(fù)這個老化問題是非常昂貴的。使用自動化工作臺進(jìn)行無中斷成像，除了減少由于偶爾的用戶錯誤而造成的不必要曝光之外，還提供了最短的運(yùn)行時(shí)間，因而有助于保持相機(jī)更長時(shí)間的高靈敏度。

植物免疫信號已得到深入研究，從而確定了許多明確的信號通路[17]。隨著越來越多的免疫成分被表征，分析更大一組植物的需求在持續(xù)生長。然而，傳統(tǒng)的耐藥檢測依賴于對病原體的手動計(jì)數(shù)，通常不利于高通量的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。因此，個別研究的重點(diǎn)是少數(shù)遺傳背景下抗性的變化。出于同樣的原因，在基因同質(zhì)系內(nèi)的抗性性狀分布很少被測量。越來越明顯的是，真核生物基因組是高度動態(tài)的，尤其是在壓力下[18,19]。這種動態(tài)性的促成因素之一是轉(zhuǎn)座因子活性的增加，其可以改變基因組[20]。因此，我們設(shè)想，一旦大規(guī)模的抗性研究成為植物病理學(xué)領(lǐng)域的規(guī)范，免疫信號因子之間的相互作用，甚至在同源遺傳背景下的抗性變異都會被發(fā)現(xiàn)。

圖3. 基于圖像的電阻分析與自動化工作臺相結(jié)合，產(chǎn)生了與傳統(tǒng)分析相媲美的定量數(shù)據(jù)。（a）基于圖像（x軸）檢測和傳統(tǒng)（y軸）檢測之間的相關(guān)性。對3.5周齡的擬南芥植株進(jìn)行注射器滲透，滲透105 CFU·mL-1發(fā)光的丁香假單胞菌。在指定的感染后的一天（dpi），用NanoGlo底物對被感染的植物進(jìn)行噴射，并使用EMCCD相機(jī)成像，如x軸所示。同樣被感染的葉片接受常規(guī)的葉片研磨試驗(yàn)，并測量其細(xì)菌滴度，如y軸所示。（b）有光和無光的代表性圖片。受感染植物的發(fā)光是在沒有光的情況下拍攝的，并以偽彩色顯示，以便于更好地分化。CFU：菌落形成單位；RLU：相對光單位。

本研究提出的自動化工作臺容納了一個傳統(tǒng)的擬南芥托盤。該工作臺可以被很容易地通過替換具有足夠容量的棒和電機(jī)來擴(kuò)展。當(dāng)涉及大規(guī)模植物成像時(shí)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對自動化的選擇是有限的。雖然先進(jìn)的自動化工具在提高表型能力方面有很大潛力，但低成本和（或）自制（DIY）表型的解決方案，如本研究提出的自動化工作臺將減少進(jìn)入壁壘[21]，并將進(jìn)一步推廣高通量方法。因此，我們希望價(jià)格合理的自動化工作臺將鼓勵更多的實(shí)驗(yàn)室致力于大規(guī)模的抗性檢測，以便更好地描述日益復(fù)雜的植物防御信號。

Acknowledgments

We thank Angela Kang for critical comments on this manuscript and John Word for feedback/help on designing the automation table. This work is supported by the National Science Foundation (IOS-1553613 to Hong-Gu Kong).

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.09.009.