張 文，黃春英，莫海濤，吳瀚翔，陸 勇，劉布鳴

（1.玉林市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 玉林 537000；2.廣西子持醫(yī)藥科技有限公司，廣西 南寧 530219）

芪蛭丹通絡(luò)膠囊主要由黃芪、川芎、丹參、地龍、燙水蛭、石菖蒲、遠(yuǎn)志、粉葛組成，具有益氣活血、化瘀通絡(luò)、醒腦開竅的功效，用于中風(fēng)恢復(fù)期和后遺癥期之氣虛血瘀證，癥見半身不遂，言語不利，口眼?斜。芪蛭丹通絡(luò)膠囊已獲得廣西醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑生產(chǎn)批件（桂藥制字Z20190003），為能更好地控制該制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，采用TLC 法對處方中黃芪、丹參進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法測定粉葛中葛根素的含量，為制訂芪蛭丹通絡(luò)膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC3000Ⅰ型高效液相色譜儀、UV3000紫外檢測器（廠家：北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；CXTH-3000 色譜工作站（廠家：北京創(chuàng)新通恒科技有限公司）；Kromasil-C18柱（瑞典EKA Chemicals 公司）；KQ5200E 型超聲波清洗儀（廠家：昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4電熱恒溫水浴鍋（廠家：常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥 黃芪對照藥材（批號：120974-200609）、丹參對照藥材（批號：120923-201113）、葛根素對照品（批號：110752-200209），購于中國藥品生物制品檢定所和中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。芪蛭丹通絡(luò)膠囊由廣西子持醫(yī)藥科技有限公司和玉林市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號：170914、170915、170916、171023、171024、171025。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪的TLC鑒別 取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇20 ml，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?.3%氫氧化鈉溶液15 ml 使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到5～6，用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，用水振搖提取2次，每次20 ml，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。另取缼黃芪陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502）［1］試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各3～5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板，以三氯甲烷-甲醇（10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（Rf 值0.50）。陰性無干擾（見圖1）。

2.2 丹參的TLC 鑒別 取本品內(nèi)容物3 g，加75%乙醇20 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。另取缼丹參陰性對照樣品3 g，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2015 年版四部通則0502）［1］試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各3～5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸試液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（Rf值0.52）。陰性無干擾（見圖2）。

圖1 芪蛭丹通絡(luò)膠囊中黃芪薄層色譜圖

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長為250 nm；流動相為甲醇-水（24∶76）；流速為1.0 ml/min；柱溫為室溫。理論塔板數(shù)按葛根素峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。

3.2 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品適量，加30%乙醇制成每1 ml含20μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，取約0.4 g，精密稱定，置25 ml 量瓶中，加30%乙醇20 ml，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加30%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 陰性對照溶液的制備 按芪蛭丹通絡(luò)膠囊處方和方法制備缺粉葛的陰性樣品，取約0.4 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備缺粉葛陰性對照溶液。

圖2 芪蛭丹通絡(luò)膠囊中丹參薄層色譜圖

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍考察 精密稱取葛根素對照品10.1 mg，置25 ml 量瓶中，用30%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成404 μg/ml 對照品溶液，備用。分別精密吸取上述對照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml，分別置10 ml量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣測定。0.5 ml 的稀釋液進(jìn)樣2.5 μl、5 μl、10μl，其余濃度的稀釋液進(jìn)樣10μl，測定，以葛根素對照品進(jìn)樣濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線為Y=41 669X-5 721.4，相關(guān)系數(shù)r2=1。結(jié)果表明：葛根素進(jìn)樣濃度在5.05～161.60μg/ml 之間與峰面積積分值呈線性關(guān)系。

3.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取葛根素對照品溶液（20.2μg/ml）和供試品溶液（批號171024）各10μl，連續(xù)進(jìn)樣6 次，依次測定峰面積值，結(jié)果對照品RSD 為0.82%（n=6），供試品RSD為1.27%（n=6）。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號供試品（批號171024）共6 份，按供試品制備項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，測定。結(jié)果測得葛根素含量為1.13 mg/g，RSD=1.38%（n=6）。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（批號171024），每隔2 h（0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h）分別進(jìn)樣10μl，測定峰面積值。結(jié)果供試品的峰面積值RSD 為1.27%（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測知含量的同一批供試品（批號171024）0.2 g（含量為1.13 mg/g）6 份，加入404μg/ml 葛根素對照品溶液0.6 ml，按供試品制備項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，測定。結(jié)果葛根素平均回收率為98.8%，RSD為0.93%（n=6），結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

（續(xù)表1）

3.10 樣品測定 按供試品的制備及檢測方法，測定6批芪蛭丹通絡(luò)膠囊中葛根素的含量，結(jié)果見表2。葛根素含量在1.105～1.258 mg/g之間。

表2 樣品中葛根素含量測定結(jié)果 （n=2）

圖3 HPLC色譜圖

4 討 論

芪蛭丹通絡(luò)膠囊由黃芪、川芎、丹參、地龍、燙水蛭、石菖蒲、遠(yuǎn)志、粉葛等組成，本研究采用TLC 法對處方中黃芪、丹參進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法測定粉葛中葛根素的含量，分析方法精密度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性均較好，并且操作簡便、快捷。

在薄層色譜研究中，本實(shí)驗(yàn)曾對方中川芎、燙水蛭、遠(yuǎn)志進(jìn)行了薄層色譜鑒別，結(jié)果供試品色譜中，在與川芎和燙水蛭對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，無相同顏色的斑點(diǎn)，故未收入標(biāo)準(zhǔn)正文；在與遠(yuǎn)志對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，有相同顏色的斑點(diǎn)，但由于未購得中國食品藥品檢定研究院的遠(yuǎn)志對照藥材，故也未收入標(biāo)準(zhǔn)正文。黃芪、丹參的薄層色譜鑒別結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好，陰性無干擾。

粉葛具有清香、升陽之功，還能醒腦開竅［2］，其指標(biāo)性成分葛根素可通過抗交感樣作用、鈣拮抗作用及廣泛的β 受體阻滯作用，發(fā)揮擴(kuò)張血管、降血糖、血脂、抗氧化的功效［3］。目前葛根素研究得比較透徹，含量測定方法較成熟，因此本研究將其作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一，采用HPLC 法測定粉葛中葛根素的含量。在供試品溶液的制備中，本試驗(yàn)對提取方法、提取溶劑、溶劑用量、提取時(shí)間進(jìn)行了單因素考察：①采取超聲30 min、加熱回流1 h、索氏提取2 h進(jìn)行提取方法的考察，結(jié)果三者提取得到的葛根素含量相差不大，但超聲提取更簡便、快捷，故采用超聲提取法；②采用甲醇、30%乙醇、乙醇進(jìn)行提取溶劑的考察，結(jié)果30%乙醇提取所得含量最高，故采用30%乙醇作為提取溶劑；③以10 ml、25 ml、50 ml 進(jìn)行提取溶劑用量的考察，結(jié)果10 ml 提取所得含量最低，25 ml 與50 ml 提取所得含量相差不大，從節(jié)省溶劑考慮，故提取溶劑量定為25 ml；④以超聲處理15 min、30 min、60 min 進(jìn)行提取時(shí)間的考察，結(jié)果15 min 提取所得含量最低，30 min 和60 min 提取所得結(jié)果無明顯差別，故提取時(shí)間定為30 min。在色譜條件摸索中，經(jīng)對葛根素紫外最大吸收波長進(jìn)行掃描，其紫外最大吸收波長為250.50 nm，故最后選定檢測波長為250 nm；以甲醇-水為流動相，考察了不同比例，最后確定甲醇-水（24∶76）的比例較為適合。