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        正交試驗優(yōu)選艾納香配方顆粒的提取工藝

        2020-09-03 07:50:40蔡雪梅王志萍謝譚芳李林霜
        廣西中醫(yī)藥 2020年4期
        關(guān)鍵詞:艾納香原兒茶酸濾液

        蔡雪梅,王志萍,謝譚芳,陳 健,李林霜

        (1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530200;3.正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,江蘇 連云港 222002)

        艾納香為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.的干燥地上部分,別名為大風(fēng)艾、牛耳艾等,具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效[1-2],民間常用于產(chǎn)后祛風(fēng)除濕、殺菌止癢。中藥配方顆粒具有免煎煮、攜帶方便、容易儲存等優(yōu)點[3-4],是中藥飲片發(fā)展的趨勢。本實驗以艾納香的有效成分原兒茶酸的含量為考察指標(biāo),以提取次數(shù)、提取時間、加水倍量作為考察因素,采用正交試驗法對艾納香配方顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

        1 實驗材料

        1.1 儀器 SQP YJ-04、CPA225D 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司];UPC-II-10T 超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司);KQ3200B 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);98-I-B 電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);島津LC-20A 高效液相色譜儀(日本島津)。

        1.2 材料 艾納香藥材購自南寧水街,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)田慧教授鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera(L.)DC.的干燥地上部分;原兒茶酸對照品(批號110809-201205,含量為99.9%)購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純,均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 原兒茶酸的含量測定

        2.1.1 色譜條件 色譜柱:美國Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(8∶92),采用等度洗脫;柱溫為30 ℃;流速為0.8 ml/min;進(jìn)樣量為15μl;檢測波長為256 nm。

        2.1.2 對照品溶液的制備 取原兒茶酸對照品適量,精密稱定,置于10 ml棕色容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配制成濃度為1.145 mg/ml 原兒茶酸對照品溶液母液。

        2.1.3 供試品溶液的制備 稱取艾納香藥材粗粉約100 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入12 倍量水浸泡使藥材充分濕潤,浸泡90 min 后加熱回流提取30 min,趁熱使用400目濾布濾過;殘渣再加入10倍水回流提取20 min,濾過,合并過濾液,再加水定容至一定體積,搖勻。取藥液2 ml,離心15 min(13 000 r/min),將上清液用0.22μm 微孔濾膜濾過,濾液即為供試品溶液。

        2.1.4 陰性溶液的制備 取甲醇溶液2 ml,用0.22μm微孔濾膜濾過,濾液即為陰性溶液。

        精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性溶液各15μl,按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰。原兒茶酸保留時間為11.87 min,與供試品其他成分分離度良好(R>1.5),陰性溶液對測定無干擾。見圖1。

        圖1 原兒茶酸含量測定HPLC色譜圖

        2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取2.0 ml原兒茶酸對照品溶液母液至25 ml的容量瓶中,加入甲醇稀釋,配制成原兒茶酸濃度為91.6μg/ml 的對照品溶液次母液,精密吸取0.2 ml、0.5 ml、2.0 ml、4.0 ml、8.0 ml、10 ml 原兒茶酸對照品次母液,分別置于10 ml的容量瓶中,加入甲醇稀釋定容至刻度,將稀釋定容后的對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件測定并記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X,μg/ml),進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程Y=72 437X-9 308.8(r=0.999 7),表 明原 兒茶 酸 濃度 在1.832~91.600μg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

        2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下的對照品溶液,按“2.1.1”色譜條件連續(xù)自動進(jìn)樣6 針,記錄下峰面積并計算RSD 值。在精密度試驗中,原兒茶酸對照品的平均峰面積為51 333 583,RSD 值為0.99%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.1.7 重復(fù)性試驗 平行稱取艾納香藥材粗粉(批號20180105)6 份,精密稱定,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄峰面積并計算RSD 值。在重復(fù)性試驗中,6 份樣品原兒茶酸峰面積平均值為190 521,RSD=1.51%(n=6),原兒茶酸平均含量為0.056 mg/g,RSD=1.30%(n=6),表明此方法的重復(fù)性良好。

        2.1.8 穩(wěn)定性試驗 稱取艾納香藥材粗粉適量(批號20180105)1 份,精密稱定,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h 進(jìn)樣,記錄峰面積并計算含量及RSD值。在穩(wěn)定性試驗中,6 個時間點測定的平均含量為0.066 mg/g,RSD 為0.18%(n=6),表明待測樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱量重復(fù)性試驗項下已測知含量的艾納香藥材粗粉6份,每份約50 g,按照藥材原兒茶酸的含量,按照1∶1比例,加入一定量的原兒茶酸對照品溶液,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”色譜條件分別進(jìn)樣,記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果加樣回收率的平均值為98.40%,RSD值為1.10%(n=6)。見表1。

        表1 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

        2.2 單因素考察提取工藝

        2.2.1 提取溶劑倍量的考察 稱取一定量的藥材粗粉于圓底燒瓶中,共8 份,分別加入8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水,浸泡90 min,回流提取60 min,過濾,取濾液2 ml 離心15 min(13 000 r/min),取上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過,續(xù)濾液用于測定原兒茶酸的含量。結(jié)果8、10、12、14、16、18、20、22 倍量水對應(yīng)的原兒茶酸的含量分別為0.033 mg/g、0.037 mg/g、0.041 mg/g、0.042 mg/g、0.044 mg/g、0.045 mg/g、0.049 mg/g、0.049 mg/g。表明隨著加水倍量的增加,原兒茶酸的含量呈現(xiàn)上升的趨勢,因此選取提取溶劑8、14、20倍量進(jìn)行正交試驗。

        2.2.2 提取次數(shù)的考察 稱取一定量的藥材粗粉5份,置于圓底燒瓶中,分別加入20 倍量水浸泡90 min,分別回流提取1、2、3、4、5 次,每次60 min,過濾藥渣,合并濾液。取濾液2 ml 離心15 min(13 000 r/min),將上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液用于測定原兒茶酸的含量。結(jié)果回流提取1、2、3、4、5次得到的原兒茶酸含量分別為0.053 mg/g、0.092 mg/g、0.101 mg/g、0.106 mg/g、0.106 mg/g,因此選擇提取1、2、3次為考察水平。

        2.2.3 提取時間的考察 稱取一定量的藥材粗粉6份,分別加入20 倍量水浸泡90 min,分別回流提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min,過濾,取濾液2 ml 離心15 min(13 000 r/min),將上清液用0.22 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液測定原兒茶酸的含量。結(jié)果得到的原兒茶酸含量分別為0.037 mg/g、0.038 mg/g、0.039 mg/g、0.044 mg/g、0.042 mg/g、0.042 mg/g。結(jié)合生產(chǎn)企業(yè)的時間效益和經(jīng)濟(jì)效益,因此選擇提取30 min、60 min、90 min為考察水平。

        2.3 正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝

        2.3.1 因素水平 根據(jù)單因素考察結(jié)果,結(jié)合對大生產(chǎn)的環(huán)境、經(jīng)濟(jì)效益等實際情況的考慮,以原兒茶酸含量為評價指標(biāo),本實驗選取加水倍量、提取時間、提取次數(shù)這3個對提取效果影響較大的因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計,考察因素水平表見表2。

        表2 因素水平表

        2.3.2 正交試驗 稱取艾納香藥材粗粉約100 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,按表3正交試驗方案安排進(jìn)行試驗,合并過濾液,搖勻。取藥液2 ml,離心15 min(13 000 r/min),將上清液用0.22μm微孔濾膜濾過,按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣測定。正交試驗方案安排及結(jié)果見表3,方差分析見表4、表5。

        表3 正交試驗方案安排與結(jié)果

        表4 方差分析結(jié)果

        表5 因素B與誤差合并后的方差分析結(jié)果

        由于因素B 與誤差小,故可與誤差合并。從表4和表5 結(jié)果可知,三個影響因素的大小為A>C>B,且A3>A2>A1,B1>B3>B2,C3>C2>C1,其中A、C 因素對提取的影響具有顯著性意義,B1、B2與B3相差不大,因此,篩選出的最優(yōu)提取工藝為A3B1C3,即在艾納香藥材中加20倍量水,提取3次,每次30 min。

        2.4 驗證試驗 按優(yōu)選出的最佳工藝對艾納香進(jìn)行提取3次,結(jié)果原兒茶酸含量高于正交試驗中的結(jié)果,表明優(yōu)選的工藝可行。見表6。

        表6 提取工藝驗證試驗結(jié)果

        3 討 論

        本實驗在建立艾納香提取液中原兒茶酸含量測定的方法中,進(jìn)行了流動相的考察,比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液不同比例(8∶92和10∶90)的分離效果,根據(jù)分離度要求,最終選擇了乙腈-0.1%磷酸水溶液(8∶92)作為流動相;對流速(0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min)和進(jìn)樣量(5μl、10μl、15μl、20μl)也進(jìn)行了考察,最終根據(jù)色譜峰的峰形及色譜峰峰面積,選擇了流速為0.8 ml/min,進(jìn)樣量為15 μl;并參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]中的測定波長,選定為256 nm。所建立的HPLC 含量測定方法,線性關(guān)系良好,靈敏度高,具有簡單、準(zhǔn)確的特點,可作為艾納香提取液的定量分析方法。

        本研究在單因素基礎(chǔ)上對艾納香藥材的提取工藝進(jìn)行了正交設(shè)計優(yōu)化,篩選出最優(yōu)提取工藝,即在艾納香藥材中加20 倍量水,提取3 次,每次30 min。并對此工藝進(jìn)行了驗證,結(jié)果表明提取工藝穩(wěn)定可靠、可行性好,可為艾納香配方顆粒的制備提供參考依據(jù)。

        (注:本文實驗數(shù)據(jù)源自蔡雪梅在廣西中醫(yī)藥大學(xué)攻讀碩士的畢業(yè)論文)

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