崔巖巖 龐麗珍 郭毓昕 向 東 張偉敏

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，?？?570228)

椰子(CocosnuciferaL.)為多年生常綠喬木，是棕櫚科椰子屬植物。椰子主要用途作為原料提取椰子油[1]。椰子油具有相對(duì)較高的熔點(diǎn)，較窄的熔融范圍，氣味清香，以及一定的抗氧化活性和酸敗性等特征[2]。它們含有豐富的短鏈脂肪酸，具有很好的消化率[3]。

傳統(tǒng)上用于植物油提取的溶劑是正己烷，盡管其具有高穩(wěn)定性和高提取率的優(yōu)點(diǎn)，但環(huán)境和安全問(wèn)題成為其用于植物油提取的主要缺點(diǎn)[4-6]。傳統(tǒng)的冷壓榨法盡管能夠最大限度地保留油脂中的營(yíng)養(yǎng)成分，但提取率偏低。隨著科技的進(jìn)步，目前植物油的工業(yè)化脫脂方法通常采用超臨界或亞臨界流體萃取。具有如下優(yōu)點(diǎn)：選用高密度，高擴(kuò)散性以及低黏度的溶劑[7]。在超臨界/亞臨界流體中的溶劑在萃取結(jié)束時(shí)可以用減壓系統(tǒng)完全分離[8]，與傳統(tǒng)方法相比，材料的傳導(dǎo)速率更快，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化速率降低，可以保護(hù)不飽和脂肪酸[9]。在椰油的生產(chǎn)加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的廢棄椰子餅粕。據(jù)報(bào)道，被視為副產(chǎn)品的椰子渣中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～25%之間，來(lái)源豐富，清蛋白和球蛋白含量大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，保健功能好，在食品工業(yè)中有美好的應(yīng)用前景[10-11]。過(guò)去的萃取方法只考慮椰子油的出油率，忽視了椰子粕的質(zhì)量，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。在加工過(guò)程中產(chǎn)生的高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性，使椰子蛋白質(zhì)的利用范圍受到極大限制，不利于其進(jìn)一步純化利用，因此造成巨大的浪費(fèi)，不符合椰子高效利用原則。所以找到一種既能保證出油率，又在能加工過(guò)程中不使椰子蛋白高溫變性的低溫萃取工藝是研究的方向和重點(diǎn)。

本研究通過(guò)對(duì)比分析溶劑萃取、液壓冷壓榨、亞臨界丁烷萃取和超臨界二氧化碳萃取四種脫脂方法得到分離蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能特性，以期為椰子油制備方法的選擇和椰子餅粕綜合利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

鮮熟椰肉(Copra)產(chǎn)自中國(guó)海南島。椰肉經(jīng)過(guò)預(yù)處理，如清洗，烘干(60 ℃，2 d)，磨粉(40目篩)，獲得椰子粕。采用溶劑提取(SE)，椰子粉(5 g)用200 mL正己烷(1∶40，g/mL)在80 ℃下提取10 h，獲得溶劑提取椰子粕。采用Kern Kraft液壓冷壓機(jī)在室溫10 MPa下機(jī)械冷壓(CP)萃取10 min，獲得冷榨椰子粕。采用CBE-5L亞臨界流體萃取設(shè)備，使用丁烷提取椰子油4次，每次35 ℃，每輪提取40 min，獲得亞臨界丁烷萃取椰子粕。采用HSFE-35-1多功能超臨界流體萃取裝置，在50 ℃進(jìn)行，28 MPa，2.5 h，CO2流量保持在200 L/h，獲得超臨界二氧化碳萃取椰子粕。對(duì)不同脫脂方法獲得的椰子粕放入40 ℃烘箱進(jìn)行脫溶處理。所有化學(xué)品均為分析純。

1.2 椰子分離蛋白的提取

使用堿性溶液從椰子粕中提取蛋白質(zhì)。取50 g樣品，過(guò)60目篩脫脂椰子粕，加入1 000 ml的0.2 mol/L pH8磷酸鹽緩沖液(1∶20)，在30 ℃下攪拌40 min后于4 ℃下6 000 r/min離心15 min，收集上清液并用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.5～4.5之間沉淀2 h。將沉淀的蛋白質(zhì)于4 ℃ 6 000 r/min離心15 min，用蒸餾水洗滌沉淀3～5次，冷凍干燥得到椰子分離蛋白。

1.3 椰子分離蛋白氨基酸組成

稱(chēng)取約50 mg均勻樣品于密封瓶中(精確到0.000 1 g)，加入10 mL 6 mol/L HCl(含1%苯酚)，充氮?dú)? min，封瓶，110 ℃水解22 h，取出冷卻，定容至10 mL，取部分90 ℃下氮吹揮干，0.01 mol/L HCl溶解定容，過(guò)膜測(cè)定。使用一級(jí)氨基酸與鄰苯二甲醛(OPA)、二級(jí)氨基酸與芴甲氧羰酰氯(FMOC)衍生后過(guò)柱檢測(cè)，使用Agilent110 0液相色譜儀進(jìn)行色譜分析，該系統(tǒng)配備有DAD檢測(cè)器，除脯氨酸(PRO)使用熒光檢測(cè)外(EX=266NM，EM=305NM),其他氨基酸使用紫外檢測(cè)(338 nm)流動(dòng)相A是40mmol/L磷酸二氫鈉(pH 7.8)；流動(dòng)相B由乙腈，甲醇，水組成。

1.4 椰子分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)

1.4.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

將干燥的沉淀蛋白質(zhì)溶解在蒸餾水中，使用渦旋混合1分鐘并以12 000 g離心10 min。將上清液蛋白質(zhì)溶液(10μL)與5μL樣品緩沖液(含含有內(nèi)含2%SDS，5%β-巰基乙醇，10%甘油0.02%溴酚藍(lán)，0.01 mol/L pH8.0Tris-HCL緩沖液5%β-巰基乙醇)混合，然后在90 ℃下加熱10 min。將15 mL每種樣品和標(biāo)記物(Precision Plus Protein All Blue標(biāo)準(zhǔn)，加載到分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%的預(yù)制聚丙烯酰胺凝膠上。電泳在電極緩沖液[0.05mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1%SDS(pH 8.3)]中開(kāi)始電泳時(shí)電壓為100 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為150 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑跑到距膠底部5 mm時(shí)，停止電泳，剝下膠片后，將膠片放入固定液中固定30 min，考馬斯亮藍(lán) R-250染色，過(guò)夜，放入脫色液中脫色，直至膠片背景藍(lán)色完全透明狀，數(shù)碼照相，分析。

1.4.2 內(nèi)源熒光光譜

根據(jù)Arogundade等[12]所述進(jìn)行內(nèi)源熒光分析，稍作修改。將椰子蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中，磁力攬拌2 h后室溫10 000r/min離心20 min收集上清液。以考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定上清液中蛋白濃度，用磷酸鹽緩沖液將蛋白濃度稀釋到0.1 mg/mL。采用F-7 000型熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm下掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜(狹縫寬度2.5)，以0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液做空白。

1.4.3 傅里葉紅外光譜

根據(jù)Shevkani等[13]測(cè)量紅外光譜和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。取2 mg椰子蛋白樣品和200 mg KBr混合，研磨均勻后制作透明薄片。使用FTIR光譜儀記錄所有光譜，掃描條件：掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，每個(gè)樣品掃描128次。

1.4.4 X-衍射

采用型號(hào)是bruker d8X衍射儀，角度范圍為2θ：5～90°進(jìn)行測(cè)定。收集濾液進(jìn)樣分析。

1.5 椰子分離蛋白理化性質(zhì)

1.5.1 椰子分離蛋白溶解度

采用Samira等[14]的方法。將蛋白質(zhì)樣品(200 mg)溶于10 mL蒸餾水中，使用3 mol/L HCL溶液將 pH調(diào)節(jié)至2～11，將這些懸浮液在室溫下超聲30 min，然后再3 500 g下離心20 min。使用考馬斯亮藍(lán)G-250方法，測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量。

(1)

1.5.2 吸水性吸油性

根據(jù)Aydemir等[15]所述進(jìn)行吸水吸油性分析，稍作修改。將20 mg蛋白質(zhì)樣品和1.5 mL蒸餾水或大豆油在2 mL離心管中均質(zhì)20 s，在30 ℃下水浴30 min，將試管在室溫下以15 000 g離心20 min，使用移液管移除游離水或油，重新稱(chēng)重樣品。吸水和吸油能力為每g蛋白質(zhì)樣品吸收的水或油的克數(shù)表示。

1.5.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

參照Coffman等[16]方法進(jìn)行，稍作修改。取20 mL蛋白質(zhì)溶液(10 mg/mL),并將其pH調(diào)至11，在30 ℃下攪拌30 min后，13 500 r/min下均質(zhì)1 min。將均質(zhì)后的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到50 mL量筒中，在0 minV0和60 minV1記錄體積。

(2)

(3)

1.5.4 乳化性EAI和乳化穩(wěn)定性ESI

參照Yeom、Pearce等[17-18]的方法進(jìn)行，稍作修改。稱(chēng)取一定量的椰子蛋白加入到去離子水中，調(diào)整濃度為1 mg/mL，取15 mL蛋白溶液與5 mL大豆油混合于100 mL燒杯中，于10 000 r/min均質(zhì)2 min后立即取樣。取20μL椰子蛋白與大豆油混合液與5 mL0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液混合，以0.1%SDS為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度值，記為A0，乳液靜置30 min后采用相同的方法測(cè)定乳液吸光度值，記為A30。

(4)

(5)

式中：N表示稀釋倍數(shù)，250；C表示樣品溶解度中蛋白質(zhì)濃度，0.001 g/mL；φ表示油相所占的分?jǐn)?shù)，0.25。

1.5.5 表面疏水性

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

除非另有說(shuō)明，否則所有測(cè)量均一式3份進(jìn)行，并且所得值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用統(tǒng)計(jì)軟件包(SPSS16.0)通過(guò)單因素方差分析評(píng)估平均值之間的差異。使用Tukey檢驗(yàn)確定實(shí)驗(yàn)之間的顯著差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸組成

不同脫脂方法的蛋白質(zhì)分離物的氨基酸組成見(jiàn)表1，除了具有最低氨基酸總量的亞臨界分離蛋白之外，椰子分離蛋白的總氨基酸含量之間沒(méi)有異常的特征。亞臨界具有最低的氨基酸含量可能的原因是，在萃取過(guò)程中氨基酸隨著萃取劑或者高壓條件下氨基酸的結(jié)構(gòu)被破壞而有很大損失。冷榨所得椰子分離蛋白質(zhì)的氨基酸含量最高，其中酸性氨基酸含量為84.08 mg/g，堿性氨基酸含量為86.87 mg/g，結(jié)果與2.2.1研究結(jié)果一致。在本研究中賴(lài)氨酸以8.31～20.78 mg/g呈現(xiàn)，可作為基礎(chǔ)飲食的谷類(lèi)蛋白質(zhì)的替代。椰子蛋白中含有豐富疏水性氨基酸，占總氨基酸含量的37%左右?？傮w而言，椰子分離蛋白具有豐富的氨基酸含量，有利于人體健康和疾病的預(yù)防，因此可以利用椰子分離蛋白作為食品和醫(yī)藥成分[20-21]。

表1 溶劑脫脂椰蓉SECPI，液壓冷榨CPCPI，亞臨界UCCPI和超臨界SECPI(CO2)椰子分離蛋白氨基酸組成

2.2 椰子分離蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)

2.2.1 SDS-PAGE

不同脫脂方法所得蛋白質(zhì)SDS-PAGE測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖可知，所有樣品的平均分子量在15～55 ku之間。椰子分離蛋白有大約20，35和50 ku的三個(gè)主要條帶，分別是谷蛋白、球蛋白和清蛋白。該結(jié)果與Rodsamran[22]所報(bào)道的椰子蛋白一致。發(fā)現(xiàn)主要的高強(qiáng)度條帶在35 ku，證明椰子分離蛋白中球蛋白的含量最高。在亞臨界和超臨界的分離凝膠的頂部保留較高的蛋白質(zhì)分子量(250 ku)，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的聚集。冷榨和溶劑提取獲得的椰子分離蛋白質(zhì)分子量較低，可能是溶劑提取的蛋白質(zhì)在高溫處理中椰子分離蛋白亞基的二硫鍵被破壞，與報(bào)道的溶劑提取的芥子蛋白質(zhì)結(jié)果相似[23]。冷榨所得蛋白質(zhì)在高壓處理下較大的蛋白質(zhì)被降解，亞基的二硫鍵被破壞，結(jié)果與報(bào)道的冷榨提取的大麻籽蛋白[24]相似。溶劑提取中在27 ku有清晰的條帶，可能歸因于高溫?zé)崽幚韺?dǎo)致蛋白質(zhì)變性[25]。此外，在所有椰子分離蛋白中存在分子量為20～27 ku和30～39 ku的條帶，分別代表存在堿性和酸性亞基[26]。該觀(guān)察結(jié)果與我們研究中的氨基酸組成一致，其含有顯著的酸性和堿性氨基酸[27]。

注：1為溶劑脫脂椰子蛋白，2為冷榨脫脂椰子蛋白，3為亞臨界脫脂椰子蛋白，4為超臨界脫脂椰子蛋白，M為marker。圖1 椰子分離蛋白的SDS-PAGE

2.2.2 內(nèi)源熒光光譜

內(nèi)源熒光光譜可用于研究蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，因?yàn)樯睔埢膬?nèi)在熒光可以反映蛋白質(zhì)的環(huán)境，是表征蛋白質(zhì)的方法[28]。不同脫脂方法所得椰子分離蛋白的熒光光譜分析結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖可知，不同脫脂方法所得椰蓉分離蛋白的熒光值由大到小分別是亞臨界、超臨界、溶劑和冷榨。對(duì)于不同脫脂方法所得椰子分離蛋白，在330 nm以上觀(guān)察到最大的熒光發(fā)射，表明部分色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)的極性環(huán)境中[29]。超臨界和亞臨界的λmax在不同程度上增加，表明高壓和低溫處理可以增加蛋白質(zhì)內(nèi)更多基團(tuán)暴露于極性環(huán)境。另一方面，對(duì)于溶劑，提取過(guò)程中溫度過(guò)高，破壞了蛋白質(zhì)分子之間的疏水鍵，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，導(dǎo)致分子內(nèi)的色氨酸殘基暴露[30]。然而，冷榨具有最低的λmax，表明液壓冷處理產(chǎn)生壓力不能改變蛋白質(zhì)的微環(huán)境。因此，變性可能導(dǎo)致酪氨酸和色氨酸殘基大量暴露于親水(水)環(huán)境，這有助于熒光猝滅[31]。亞臨界和超臨界的蛋白質(zhì)變性程度較低，這減少了酪氨酸和色氨酸暴露于親水環(huán)境，因此有更高的熒光值。所有脫脂方式最大熒光值(336 nm)的波長(zhǎng)變化非常小，這表明在樣品的色氨酸微環(huán)境是相似的[32]。綜上所述，不同脫脂方法可能導(dǎo)致椰子分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

注：在280 nm激發(fā)(對(duì)于色氨酸)。SECPI，CPCPI，UCCPI和SECPI(CO2)分別來(lái)自溶劑脫脂椰蓉，液壓冷榨，亞臨界和超臨界提取椰子分離蛋白。圖2 椰子分離蛋白的內(nèi)在熒光光譜

2.2.3 傅里葉紅外光譜

以投資主體一體化帶動(dòng)流域治理一體化，是汾河流域生態(tài)保護(hù)與修復(fù)建設(shè)管理模式的重大創(chuàng)新和重要實(shí)踐。汾河流域投資公司主要負(fù)責(zé)汾河流域生態(tài)保護(hù)與修復(fù)項(xiàng)目的總體實(shí)施、投融資運(yùn)作和風(fēng)險(xiǎn)防控，以市場(chǎng)化方式組織實(shí)施汾河流域生態(tài)保護(hù)與修復(fù)項(xiàng)目，統(tǒng)籌各級(jí)政府用于項(xiàng)目的資金，積極參與流域內(nèi)水庫(kù)、供水、污水處理、垃圾處理等項(xiàng)目的投資建設(shè)和經(jīng)營(yíng)管理。

注：SECPI，CPCPI，UCCPI和SECPI(CO2)分別來(lái)溶劑，液壓冷榨，亞臨界和超臨界脫脂椰蓉提取椰子分離蛋白。圖3 椰子分離蛋白傅里葉變換紅外光譜

2.2.4 XRD

XRD用于確定蛋白質(zhì)的復(fù)雜折疊行為，某些氨基酸/氨基酸序列傾向于形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如α-螺旋，β-轉(zhuǎn)角，β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲[39]。圖4顯示了椰子分離蛋白的XRD圖譜。UCCPI和SECPI(CO2)在約16.1°和20.5°處分別顯示出兩個(gè)衍射峰。SECPI和CPCPI在20.6°處顯示出一個(gè)較小的衍射峰。Chen等[40]報(bào)道，蛋白質(zhì)X射線(xiàn)衍射圖中2θ角接近9°和21°的峰分別屬于 α-螺旋和 β-折疊結(jié)構(gòu)。在所有脫脂方式中都未發(fā)現(xiàn)9°的衍射峰，證明在脫脂過(guò)程中的高壓和高溫破壞了蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)。衍射曲線(xiàn)顯示UCCPI和SECPI(CO2)的部分結(jié)晶度，其在20.5°左右的較明顯的峰值表明較大比例的緊密結(jié)合結(jié)構(gòu)(較小的填充距離)以犧牲結(jié)構(gòu)間填充為代價(jià)，這表明UCCPI和SECPI(CO2)具有較高比例的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)。與前面的SDS-PAGE等關(guān)于蛋白質(zhì)聚集程度的研究結(jié)果一致。SECPI和CPCPI衍射峰較小，其原子隨意排列，沒(méi)有特定的空間結(jié)構(gòu)。

注：CPI，SECPI，CPCPI，UCCPI和SECPI(CO2)分別來(lái)自原始椰蓉，溶劑脫脂椰蓉，液壓冷榨，亞臨界和超臨界提取椰子分離蛋白。圖4 椰子分離蛋白的X射線(xiàn)衍射圖

2.3 椰子分離蛋白理化性質(zhì)

2.3.1 蛋白質(zhì)溶解度

pH對(duì)不同脫脂方法所得椰子分離蛋白溶解度曲線(xiàn)的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，不同脫脂方法表現(xiàn)出典型的PS曲線(xiàn)，在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)3.5～4.5之間觀(guān)察到最低的溶解度，是因?yàn)楫a(chǎn)生了不溶性蛋白質(zhì)聚集體，在pH 5.0時(shí)最低，并且隨pH增加而增加，在pH 11.0下達(dá)到最高值。觀(guān)察到在堿性pH椰子分離蛋白的溶解度顯著高于酸性pH，是因?yàn)樘岣遬H(高于等電點(diǎn))導(dǎo)致凈蛋白質(zhì)電荷增加，這個(gè)結(jié)果與芝麻分離蛋白[41]和腰果分離蛋白[42]結(jié)果相似。不同脫脂椰子分離蛋白在pH 6.0～11.0條件下溶解度也不同，冷榨椰子分離蛋白比亞臨界萃取所得椰子分離蛋白的溶解度要低，說(shuō)明不同處理會(huì)對(duì)椰子分離蛋白溶解性有影響，其原因可能是液壓冷壓榨的高壓處理增強(qiáng)了蛋白質(zhì)之間相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和沉淀，從而降低了蛋白質(zhì)與水之間的相互作用幾率，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白的溶解性降低，這種結(jié)果與Ivanova[43]和Ghribi[44]的研究基本一致。

注：SECPI，CPCPI，UCCPI和SECPI(CO2)分別來(lái)自溶劑，液壓冷榨，亞臨界和超臨界脫脂椰蓉提取椰子分離蛋白。圖5 蛋白質(zhì)分離物的溶解度曲線(xiàn)

2.3.2 吸水性與吸油性

不同脫脂方法所得椰蓉蛋白吸水性與吸油性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，由表可知，不同脫脂方法所得椰子分離蛋白吸水性最高的是亞臨界(10.43 g/g)，其次是冷榨(4.43 g/g)和溶劑萃取(4.25 g/g)，超臨界(2.45 g/g)所得椰子分離蛋白吸水性最低。幾種內(nèi)在特征(蛋白質(zhì)構(gòu)象，親水性，氨基酸的親水平衡等)和環(huán)境參數(shù)(pH，離子強(qiáng)度，溫度)被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)結(jié)合水能力的原因[45]。采用液壓冷壓榨的椰子蛋白的WAC高于溶劑提取的椰子蛋白，結(jié)果與Labuckas[46]報(bào)道一致。這是因?yàn)槿軇┟撝苽涞囊拥鞍自谳^高的溫度下開(kāi)始變性，構(gòu)象也隨之發(fā)生改變，蛋白質(zhì)氫鍵作用和離子基團(tuán)水合作用減弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水性的差異。椰子分離蛋白的吸油性的范圍為3.17%～6.17%，其中最高的是亞臨界，最低的是冷榨，它們之間存在顯著性差異(P<0.05)。溶劑法脫脂處理的高溫使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，使其持油性變差。冷榨法脫脂時(shí)的高壓使肽鏈伸展，親水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致椰子蛋白持油性變差。亞臨界脫脂處理的椰子蛋白持油性最好，為6.17%，可能是整個(gè)萃取過(guò)程可以在室溫或更低的溫度下進(jìn)行，不會(huì)對(duì)活性蛋白造成損害，可以吸收更多油脂，因而持油性好。椰子分離蛋白的WAC和OAC值與花生[47]和大豆蛋白[48]的報(bào)道值一致。

2.3.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

許多情況下需要蛋白質(zhì)的發(fā)泡性質(zhì)(FC和FS)，在食品系統(tǒng)中用于通氣和攪打[49]。不同脫脂方法對(duì)椰子蛋白起泡能力和泡沫穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表2，由表可知，本研究中椰子蛋白發(fā)泡能力的范圍為15%～30%，不同油脂提取方法對(duì)椰子蛋白起泡性影響最大的是溶劑提取，達(dá)到30.50%，影響最小的是冷榨，低至15.30%，超臨界和亞臨界的起泡能力分別為28.25%和17.25%。因?yàn)槿軇┨崛∵^(guò)程中溫度過(guò)高，引起蛋白質(zhì)的變性導(dǎo)致其更大的展開(kāi)結(jié)構(gòu)，使更多的水氣界面相互作用，產(chǎn)生較高的起泡性[50]。良好的發(fā)泡能力和蛋白質(zhì)分子之間柔韌性之間存在聯(lián)系，可以降低其表面張力，而球狀蛋白質(zhì)表面相對(duì)難以變性，可能導(dǎo)致較低的起泡能力。溶劑和超臨界的泡沫穩(wěn)定性之間存在顯著性差異，且其泡沫穩(wěn)定性較好，分別為25.25%和10.25%。來(lái)自冷榨和亞臨界的兩種蛋白質(zhì)粉末的泡沫穩(wěn)定性是相似的，在5.50%～6.75%范圍內(nèi)。泡沫穩(wěn)定性取決于氣泡周?chē)纬傻暮竦膬?nèi)聚層。冷榨椰子分離蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最低，表明低溫使其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)較少，蛋白質(zhì)的變性程度最低。在溶劑和超臨界中觀(guān)察到高FC和FS值。它們可被認(rèn)為是適用于不同食品的發(fā)泡成分，例如蛋糕，面包，生奶油，冰淇淋和一些糖果產(chǎn)品。

2.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性能主要取決于降低油水界面處的張力并通過(guò)形成吸附層來(lái)控制油滴的擴(kuò)散和聚集[51]。乳化性和蛋白質(zhì)溶解度，表面電荷，表面疏水性和分子靈活性相關(guān)。不同脫脂方式對(duì)椰子蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響見(jiàn)表2，由表可知，不同油脂脫脂方法對(duì)椰子分離蛋白乳化性影響最大的是溶劑提取，高達(dá)46.65%、其次是亞臨界和冷榨，分別為42.38%和37.54%。超臨界的值最低，為31.41%。由于溫度的升高，蛋白質(zhì)的變性程度增大，球形蛋白質(zhì)的解離和部分分解折疊，變性的蛋白質(zhì)暴露出疏水基團(tuán)，使表面活性在油和水界面的吸附增加[52]，從而溶劑提取有較高的EAI。所有椰子分離蛋白的ESI值在20.36～29.31 min之間。超臨界和冷榨具有更高的ESI，是因?yàn)槊撝^(guò)程中發(fā)生了更大程度的多肽折疊，獲得更大的蛋白質(zhì)表面積，乳化活性增強(qiáng)[53]。高ESI表明它可以?xún)?yōu)選用作水包油乳液中的乳化劑。溶劑提取的ESI值最低，是由于提取溫度過(guò)高使蛋白質(zhì)相互交聯(lián)從而有較低的乳化穩(wěn)定性[54]。

表2 來(lái)自溶劑脫脂椰蓉SECPI，液壓冷榨CPCPI，亞臨界UCCPI和超臨界SECPI(CO2)椰子分離蛋白的功能特性

2.3.5 表面疏水性

椰子分離蛋白在pH 7.00下的表面疏水性如圖6所示。結(jié)果表明H0最高的為溶劑。其次是超臨界和冷榨，最低的是亞臨界，它們之間存在顯著性差異(P<0.05)。溶劑提取過(guò)程中溫度過(guò)高，蛋白質(zhì)變性程度增大，暴露出蛋白質(zhì)分子的疏水性殘基，是表面疏水性增強(qiáng)。而冷榨、亞臨界和超臨界具有較低的H0可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)聚集[55]，游離巰基的含量較低，蛋白質(zhì)分子的解折疊程度較低，具有更少的疏水性殘基暴露于蛋白質(zhì)分子表面，導(dǎo)致表面疏水性降低。亞臨界具有最低的表面疏水性可能因?yàn)槠涫杷园被岷孔畹?見(jiàn)表1)。不同脫脂方式可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與亞基分離，暴露出疏水側(cè)鏈導(dǎo)致其H0的增加與側(cè)鏈結(jié)合導(dǎo)致ANS的熒光強(qiáng)度增加(見(jiàn)圖2)。Kato等[56]研究表明，不同的樣品制備方法可以導(dǎo)致其構(gòu)象變化，油水界面以疏水相互作用為主，界面處非極性疏水基團(tuán)的暴露極大程度地影響其乳化性質(zhì)。

注：SECPI、CPCPI、UCCPI和SECPI(CO2)分別來(lái)自溶劑，液壓冷榨，亞臨界和超臨界脫脂椰蓉提取椰子分離蛋白。圖6 椰子分離蛋白的表面疏水性

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了不同脫脂方法對(duì)椰子分離蛋白變性程度的影響，結(jié)果如下：1)不同脫脂方式會(huì)影響椰子分離蛋白的結(jié)構(gòu)，經(jīng)SDS-PAGE圖譜和FTIR分析證實(shí)。2)在具有高H0的SECPI(CO2)和具有高熒光值的UCCPI分析顯示較少變性和更多折疊的構(gòu)象。3)UCCPI顯示出高WAC/OAC以及乳化穩(wěn)定性。結(jié)果表明亞臨界丁烷萃取椰子粕的蛋白質(zhì)可以有效地用于食品工業(yè)。