姚倫芳

(1.貴州省環(huán)境與工程評估中心；2.貴州綠興清源環(huán)保有限責(zé)任公司，貴陽 550002)

有機(jī)污染物(如PAHs)在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化和生物有效性主要取決于污染物與土壤不同組分之間的相互作用，其中黏土礦物和土壤有機(jī)質(zhì)被認(rèn)為是影響有機(jī)污染物在土壤環(huán)境中的行為的兩個(gè)最重要因素[1]。土壤環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)一般以游離態(tài)與結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其中游離態(tài)有機(jī)質(zhì)主要包括動(dòng)植物殘?bào)w和微生物生物量，而結(jié)合態(tài)主要是有機(jī)礦質(zhì)復(fù)合體，其中的有機(jī)質(zhì)主要鎖定在土壤微團(tuán)聚體內(nèi)部或吸附在礦物表面[2]。比重分組法是研究土壤有機(jī)質(zhì)常用的分組方法，Greenland等[3]首次采用該方法對土壤有機(jī)質(zhì)進(jìn)行了分組，將土壤中相對密度小于2.0 g·cm-3的組分定義為輕組(Light fraction, LF)，而相對密度大于2.0 g·cm-3的組分定義為重組(Heavy fraction, HF)。根據(jù)腐殖質(zhì)與礦物結(jié)合的松緊程度，又可將重組有機(jī)質(zhì)分為松結(jié)態(tài)、穩(wěn)結(jié)態(tài)和緊結(jié)態(tài)三種形態(tài)[4]。其中，輕組有機(jī)質(zhì)生物活性較高，與之結(jié)合的污染物生物可利用性較高；而重組有機(jī)質(zhì)一般以有機(jī)礦質(zhì)復(fù)合體的形態(tài)存在，生物活性相對較低，與之結(jié)合的污染物生物可利用性也較低[5]。在本課題組前期研究基礎(chǔ)上[6]，通過對比未經(jīng)生物修復(fù)和經(jīng)生物修復(fù)土壤不同有機(jī)組分中PAHs含量的變化情況，研究污染物在土壤不同組分的分布特征，對正確評估污染土壤PAHs生物有效性和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

溴化鋅、無水焦磷酸鈉、氫氧化鈉、二氯甲烷、環(huán)己烷、無水硫酸鈉等均為分析純，購于國藥公司，上機(jī)用乙腈、層析硅膠為色譜純，購于美國Tedia公司。

1.2 供試土壤

在溫室條件下(25℃，12 h黑暗/光照交替)，采用盆栽實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理：(1)接種滅活菌劑(將木霉菌孢子懸液(接種量10%)接種在由麥麩和橘皮(1:1)制成的固體基質(zhì)中，28 ℃條件下培養(yǎng)72 h，制成固體菌劑)，不種植紫花苜蓿(CK)；(2)接種滅活菌劑，種植紫花苜蓿(A)；(3)接種木霉菌菌劑，種植紫花苜蓿(TA)；(4)接種木霉菌、根瘤菌復(fù)合菌劑，種植紫花苜蓿(TRA)。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每盆裝供試土壤1.5 kg，菌劑150 g，加去離子水調(diào)節(jié)土壤水分至田間持水量的60%左右。選取催芽后的紫花苜蓿直接播種于裝好供試土壤的花盆中，10 d后間苗，每盆留苗10株。試驗(yàn)期間土壤水分維持在田間持水量的60%左右，培養(yǎng)60 d后分別采集土壤和植物樣品。土壤樣品過2 mm篩后分成兩部分，一部分冷凍干燥，用于PAHs的提取測定，另一部分4℃冷藏，用于土壤微生物活性的測定。

本研究供試土壤采用盆栽實(shí)驗(yàn)土壤，選取其中種植紫花苜蓿并接種木霉菌-根瘤菌復(fù)合菌劑處理的土壤(樣品編號：BS，樣品數(shù)：4)和無植物種植和微生物接種處理的土壤(樣品編號：CK，樣品數(shù)：4)進(jìn)行分析。

1.3 分析測試方法

1.3.1 土壤不同有機(jī)組分的分離

稱取30 g凍干土樣(<2 mm)置于200 mL特氟龍離心管中，加入100 mL ZnBr2(比重為1.8 g·cm-3)溶液，將離心管置于搖床振蕩60 min，靜置分層，然后2500 rpm離心10 min，將懸浮固體用事先恒重的Whatman 1#濾紙過濾，并用去離子水沖洗干凈。離心管中剩下的土壤再用100 mL ZnBr2重復(fù)分離一次。將兩次得到的固體合并、凍干、稱重，得到輕組(LF)。離心管中余下的土壤用去離子水多次沖洗，去除殘留ZnBr2，凍干、稱重，最終得到重組(HF)。第一步得到的重組再分離得到松結(jié)態(tài)(H1)、穩(wěn)結(jié)態(tài)(H2)和緊結(jié)態(tài)(H3)。將10 g重組土壤置于200 mL特氟龍離心管中，加入120 mL 0.1 mol·L-1NaOH溶液，25℃、200 rpm振蕩過夜，12 000 rpm離心15 min，將上層懸浮固體轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中，重復(fù)提取4～5次，直至溶液澄清，合并提取物，得到H1。離心管中剩余土壤加入100 mL 0.1 mol·L-1NaOH+0.1 mol·L-1Na4P2O7混合溶液，方法同上，重復(fù)3～4次操作，直至溶液澄清，合并提取物，得到H2；殘留在剩余土壤中的有機(jī)質(zhì)則為H3。離心管中剩余的土壤用去離子水沖洗至溶液pH大約為7，凍干備用。

1.3.2 不同土壤組分中多環(huán)芳烴的提取及檢測

HF、LF、H3中PAHs使用索氏提取法提取，稱取2.0 g凍干土樣與2.0 g無水硫酸鈉混合均勻置于索氏提取管中，向茄形瓶中加入二氯甲烷70 mL，提取24 h，提取后樣品于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干(36℃)，然后向茄形瓶中加入2.0 mL環(huán)己烷溶解瓶中物質(zhì)，取0.5 mL溶液過硅膠柱，用正己烷和二氯甲烷混合液(v/v，1∶1)洗脫，棄去起初的 1.0 mL洗脫液，收集2 mL洗脫液于刻度試管中，用高純氮?dú)獯蹈?，?2.0 mL乙腈溶解，使用HPLC測定。H1、H2溶液分別與50 mL二氯甲烷混合置于500 mL棕色玻璃瓶中，25℃、200 rpm振蕩24 h，靜置分層，吸取20 mL有機(jī)相置于100 mL茄形瓶中，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干(36℃)，然后向茄形瓶中加入 2.0 mL環(huán)己烷溶解瓶中物質(zhì)，取0.5 mL溶液過硅膠柱，用正己烷和二氯甲烷混合液(v/v，1:1)洗脫，棄去起初的1.0 mL洗脫液，收集2 mL洗脫液于刻度試管中，用高純氮?dú)獯蹈桑?2.0 mL乙腈溶解，使用HPLC測定。

HPLC為日本島津Class-vp高效液相色譜分析系統(tǒng)，配熒光檢測器RF-10AXL,柱溫箱OT-10ASVP柱溫30 ℃，二元體鍍泵LC-10AT，色譜分離柱為美國Varian公司的ChromSpher 5 PAH(VPODS150_4.6mm I. D．，particlesize 5 mm，Shimadzu)，流動(dòng)相為乙腈/水(65:35)，流速為1.5 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，梯度洗脫程序?yàn)椋阂译娴某跏俭w積分?jǐn)?shù)為80%，終點(diǎn)體積分?jǐn)?shù)為100%，洗脫時(shí)間20 min。

土壤PAHs總量回收率按輕組和重組中PAHs含量以及它們質(zhì)量比計(jì)算得出原土中PAHs總量與原土中實(shí)測的PAHs總量百分比。重組中PAHs總量回收率按松結(jié)態(tài)、穩(wěn)結(jié)態(tài)和緊結(jié)態(tài)中PAHs含量以及它們質(zhì)量比計(jì)算得出重組中PAHs總量與重組中實(shí)測的PAHs總量百分比。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)處理使用Office Excel 2007進(jìn)行，圖形采用Origin 8.0制作完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤分組的質(zhì)量回收率和多環(huán)芳烴回收率

土樣BS、CK進(jìn)行輕組和重組分離之后，其質(zhì)量回收率分別為87.21%、90.35%(表1)，表明分組過程中土壤損失量較少。BS、CK中PAHs總量回收率分別為100.64%、103.74%；重組在進(jìn)行松結(jié)態(tài)、穩(wěn)結(jié)態(tài)和緊結(jié)態(tài)分組之后，PAHs總量回收率分別為106.16%、124.74%(表2)。可以看出，在進(jìn)行土壤分組之后，PAHs的回收率均高于100%，這可能是分組之后增加了土壤顆粒與提取溶劑的接觸面積，很多鎖定在土壤中的PAHs在原土中未被提取出，而在分組之后被提取出[2]。其他研究也表明，一些土樣在粒徑分組和有機(jī)組分分組之后組分中PAHs的含量總和也高于原土中PAHs的含量[7-8]，另外土壤的基質(zhì)效應(yīng)也是多環(huán)芳烴回收率的影響因素[9]。

表1 土壤分組的質(zhì)量回收率

表2 土壤分組的PAHs回收率

2.2 多環(huán)芳烴在土壤輕組和重組中的分配

圖1顯示了兩種土壤輕組和重組中PAHs含量，CK輕組中總PAHs含量為143885 μg·kg-1，重組中總PAHs含量為2643 μg·kg-1；而BS輕組中總PAHs含量為58886 μg·kg-1，重組中總PAHs含量為2559 μg·kg-1。輕組中PAHs 的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過重組中PAHs的含量，這是因?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)是土壤中PAHs的主要吸附劑，而輕組有機(jī)質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于重組，因而對PAHs的吸附量也高于重組[2]。圖2是輕組和重組中PAHs總量占原土中PAHs總量的相對百分比，CK輕組中PAHs總量占原土中PAHs總量百分比為69%，而輕組重量只占原土重量的4%；BS輕組中PAHs總量占原土中PAHs總量百分比為63%，而輕組重量只占原土重量的7%。另外，可以看出，經(jīng)不同處理的土壤輕組含量和其輕組中PAHs含量發(fā)生了一定的變化，特別是后者，相較于CK而言，BS輕組中PAHs含量降低了59%，但是重組中PAHs含量的變化則不大，僅僅降低了3%，這說明土壤輕組中的PAHs生物可利用性較高，在對污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)時(shí)，其去除的污染物主要集中在土壤輕組有機(jī)質(zhì)中，而存在于重組中的PAHs由于其生物活性低，大多難以生物利用，另一方面這部分的污染物環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也較低。研究表明，輕組有機(jī)質(zhì)被土壤礦物吸附較松，主要游離于土壤溶液中，與之結(jié)合的污染物的有效性較高，更容易被生物利用[6]。

圖1 供試土樣輕組(LF)和重組(HF)中PAHs含量

圖2 輕組(LF)和重組(HF)PAHs含量占原土PAHs總量的百分比

2.3 重組多環(huán)芳烴在結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)中的分配

圖3顯示了重組PAHs在結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)中的分配情況，可以看出，BS、CK重組中PAHs主要分布在緊結(jié)態(tài)腐殖質(zhì)組分中，分別占重組中PAHs總量的97.63 %、97.59%。穩(wěn)結(jié)態(tài)腐殖質(zhì)和松結(jié)態(tài)腐殖質(zhì)結(jié)合的PAHs占重組中PAHs總量的百分比較小，CK中分別為0.95%、1.12%, BS中分別為1.16%、1.15%。根據(jù)不同結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)與礦物結(jié)合的松緊程度，可以推斷出不同結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)的生物有效性程度大小順序?yàn)樗山Y(jié)態(tài)>穩(wěn)結(jié)態(tài)>緊結(jié)態(tài)，那么不同結(jié)合態(tài)腐殖質(zhì)結(jié)合的PAHs生物有效性程度的大小也應(yīng)為松結(jié)態(tài)-PAHs>穩(wěn)結(jié)態(tài)-PAHs>緊結(jié)態(tài)-PAHs。從這種角度看，PAHs污染土壤的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)主要在于與輕組有機(jī)質(zhì)結(jié)合的PAHs，如果能夠從污染土壤中分離出輕組，那么剩余重組結(jié)合的PAHs絕大部分生物有效性較低，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也就相對較小。

圖3 松結(jié)態(tài)(H1)、穩(wěn)結(jié)態(tài)(H2)和緊結(jié)態(tài)(H3)PAHs總量占重組PAHs總量的百分比

3 結(jié)論

本次研究結(jié)果表明，生物修復(fù)土壤和對照土壤中輕組含量所占比例很小，分別只有7%和4%，但它結(jié)合的PAHs量比例很大，分別達(dá)到土壤中PAHs總量的63%和69%；重組中PAHs的含量主要分布在緊結(jié)態(tài)腐殖質(zhì)中，分別占重組PAHs總量的97.59%、97.63%。PAHs在土壤中的分布，主要集中在輕組組分中，其活性較大，容易被生物所利用，而重組組分中的PAHs由于結(jié)合緊密，活性小，難以被生物利用；生物修復(fù)對PAHs污染土壤有較好的修復(fù)效果，但不會(huì)對PAHs在土壤不同有機(jī)組分中的分布產(chǎn)生較大影響。從土壤中PAHs在不同有機(jī)質(zhì)組分中的分配來看，PAHs污染土壤的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)可能主要在于和輕組有機(jī)質(zhì)結(jié)合的PAHs。