腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]。 近年來，腎癌的發(fā)病率和死亡率不斷上升[2]。腎癌的組織學(xué)亞型包括透明細胞癌、乳頭狀癌和嫌色細胞癌，其中腎透明細胞癌是最常見的亞型，占70%～80%[3]。腎透明細胞癌容易侵入局部組織并轉(zhuǎn)移，對目前可用的治療方法具有耐藥性，手術(shù)仍是腎透明細胞癌最有效的治療方法。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的主要場所，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的功能是確保新合成的蛋白質(zhì)正確折疊。隨著癌細胞增殖過程中蛋白質(zhì)合成的增加，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的活性要求越來越高，這可能導(dǎo)致癌細胞中未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的激活[4，5]。雖然傳統(tǒng)上認為這類蛋白主要負責(zé)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)它們在調(diào)節(jié)增殖、凋亡和免疫方面也起著關(guān)鍵作用[4，6]。此外，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與其他細胞間隔的高度互聯(lián)性，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶的功能也可能通過調(diào)節(jié)促癌和促生存信號而超出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[7，8]。因此，干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白則是發(fā)展抗腫瘤治療的新方向。研究表明，P4HB 在許多類型癌癥細胞中表達上調(diào)，其表達與癌癥進展和臨床結(jié)局相關(guān)[9]。本研究從Oncomine 數(shù)據(jù)庫中提取并挖掘關(guān)于腎透明細胞癌中P4HB 基因表達的數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier Plotter 探討其與腎透明細胞癌預(yù)后的關(guān)系，為更進一步分析P4HB 基因在腎透明細胞癌發(fā)病過程中的分子機制提供新線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 OncomineOncomine （http：//www.oncomine.org） 是一個在線數(shù)據(jù)庫，其中包含多種人類癌癥基因表達數(shù)據(jù)。從Oncomine 數(shù)據(jù)庫中提取并挖掘腎透明細胞癌中P4HB 基因的表達數(shù)據(jù)，條件設(shè)置為：①Gene：P4HB；②Data type：mRNA；③Cancer type：kidney cancer；④Analysis type：normal vs cancer analysis；⑤其他條件設(shè)置：fold change＞2，P 1E-4，gene rank= top 10%。

1.2 CCLECCLE（癌癥細胞系的百科全書，www.broadinstitute.org/ccle/home）是Broad 研究所與諾華研究基金會聯(lián)合開發(fā)的合作項目，進行人類癌癥模型開發(fā)整合計算分析，并將細胞系整合基因組學(xué)轉(zhuǎn)化為癌癥患者分層。CCLE 提供了對超過1 000 個細胞系的基因組數(shù)據(jù)、分析和可視化的公共訪問[10]。通過搜索基因符號P4HB，利用CCLE 分析工具自動生成P4HB 在不同癌癥中的表達情況。

1.3 HPA使用HPA 病理學(xué)圖譜（www. proteinatlas.org）對比分析腎癌組織和正常腎組織中P4HB 蛋白質(zhì)含量，在Tissue Atlas 和Pathology Atlas 中輸入P4HB，分別選擇Renal 和Renal cancer，生成免疫組織化學(xué)圖。

1.4 Kaplan-Meier Plotter通過Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）進 行 在線生存分析。篩選條件：①Cancer：renal clear cell carcinoma；② Gene：P4HB；③Survival：OS。

2 結(jié)果

2.1 P4HB 在不同類型腫瘤中的表達在Oncomine數(shù)據(jù)庫中關(guān)于P4HB 基因共收集到447 項不同類型的研究結(jié)果，其中有統(tǒng)計學(xué)意義的44 項，P4HB 基因在癌癥組織中高表達32 項，低表達12 項，在腎癌中高表達6 項，低表達0 項（見表1），同時發(fā)現(xiàn)P4HB 在正常腎組織與腎透明細胞癌中表達具有明顯差異，見圖1。

表1 P4HB 在多種腫瘤中的表達（n）

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中不同腎透明細胞癌數(shù)據(jù)集中的表達

2.2 P4HB 在腎癌中的表達利用CCLE 在線工具分析P4HB 在癌組織中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P4HB 在腎癌中高表達，見圖2。

2.3 P4HB 在正常腎組織及腎癌中表達的免疫組化結(jié)果Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫中免疫組化染色證實了人類蛋白圖譜中P4HB 蛋白在腎癌中相對正常腎組織表達明顯增加，見圖3。

2.4 P4HB 與腎透明細胞癌預(yù)后的關(guān)系通過上述數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)P4HB 在腎透明細胞癌或腎癌組織中表達顯著升高，為進一步明確P4HB 表達與腎透明細胞癌預(yù)后之間的關(guān)系，利用Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn)，P4HB 的基因表達與腎透明細胞癌患者預(yù)后存在相關(guān)性，且P4HB 高表達患者的總體生存率較低，而低表達患者總體生存率較高，見圖4。

圖2 CCLE 數(shù)據(jù)庫中P4HB 在不同腫瘤細胞系的表達

圖3 P4HB 在正常腎組織和腎癌中的表達

圖4 P4HB 高表達及低表達腎透明細胞癌患者的預(yù)后

3 討論

脯氨酰4-羥化酶β亞基（P4HB）是主要的伴侶蛋白之一[13]，其作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶以抑制錯誤折疊蛋白的聚集[14]。P4HB 在多種腫瘤中高表達并可促進腫瘤的發(fā)展，導(dǎo)致患者預(yù)后較差[9]。P4HB在非小細胞肺癌（NSCLC）中過度表達，藥物治療后P4HB 表達降低預(yù)示著更好的臨床結(jié)果[13]；P4HB在人肝細胞癌組織中上調(diào)，并促進肝細胞癌增殖和遷移[15]；P4HB 抑制增強了耐藥膠質(zhì)瘤細胞的化學(xué)敏感性[16，17]。雖然在大部分正常組織中P4HB 呈低表達，但在肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)腸癌中呈高表達，目前尚未查閱到應(yīng)用生物信息學(xué)分析探討P4HB 在腎透明細胞癌中作用的相關(guān)報道。

Oncomine 數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大的基因芯片數(shù)據(jù)和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，注冊用戶可提取和挖掘腫瘤相關(guān)基因信息。本研究中，Oncomine 數(shù)據(jù)集顯示，P4HB 在腎透明細胞癌中的表達高于正常組織，且在大多數(shù)腫瘤組織中均呈高表達，說明P4HB是促癌基因的可能性大。通過CCLE 在線分析進一步驗證了P4HB 在腎癌中的高表達，應(yīng)用Human Protein Atlas 蛋白數(shù)據(jù)庫證實P4HB 在腎癌組織中顯著高表達，進一步提示P4HB 可能促進腎透明細胞癌的發(fā)生和發(fā)展。為進一步研究P4HB 與腎透明細胞癌預(yù)后的關(guān)系，使用Kaplan-Meier Plotter 進行分析，該繪圖儀是包括基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)的在線數(shù)據(jù)庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P4HB 高表達患者的死亡率更高，預(yù)后更差。說明如果降低P4HB 的表達或許可以改善腎透明細胞癌患者的預(yù)后，同時可能為靶向藥物研究提供參考和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究通過對公共數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘并對相關(guān)信息進行綜合分析，結(jié)果表明P4HB 在腎透明細胞癌中高表達，生存分析提示P4HB 與腎透明細胞癌患者預(yù)后相關(guān)，為揭示腎透明細胞癌的發(fā)病機制及識別與腎透明細胞癌相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物提供參考，但其潛在機制仍有待進一步研究。