動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最常見的病因之一，是中風、心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛和心臟性猝死的潛在原因，是一種動脈壁的慢性炎癥疾病，主要累及大中型動脈，尤其是血管分支和管腔迂曲明顯的部位，動脈急性閉塞所致的心肌梗死和腦卒中是最重要的并發(fā)癥[1]。過度飲酒、吸煙、飲食不規(guī)律、長期缺乏運動、肥胖可促進心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，引起過早死亡[2]。血管平滑肌細胞（vascular smooth cells，VSMCs）是動脈壁的主要成分之一，研究證明VSMCs 的異常增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中重要的病理生理基礎，在動脈粥樣硬化斑塊的形成和最終破裂中起著關鍵作 用[3～5]。所以尋找針對VSMCs 功能的策略對動脈粥樣硬化治療具有重要意義[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是22nt 左右的非編碼RNA，其通過抑制靶基因的翻譯或者降解mRNA 來調控基因的表達，從而對多種疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[6～8]。研究證實，miR-106b 在心腦血管疾病[9]、子宮內膜癌[10]、慢性淋巴細胞白血病[11]、肝癌[12]等多種疾病中發(fā)揮重要作用。戴冬偉等[13]研究顯示，miR-106b 在煙霧病患者血清中呈高表達，mTOR 信號通路與煙霧病發(fā)病可能相關。Zhang 等[9]研究顯示，上調miR-106b 可抑制動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡。Liu等[14]研究表明，重復性磁刺激可以調控miR-106b表達，刺激神經(jīng)祖細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)miR-106b 是一個評估癲癇的生物標志物[15]。本研究分析動脈粥樣硬化中miR-106b 的表達量，探討其通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路對Hcy 誘導的VSMCs細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集我院2019年6～12月診斷為動脈粥樣硬化42 例患者的血清（患病組）及25 例健康志愿者血清作為對照（對照組），參考相關診斷標準[2]，患病組為臨床動脈粥樣硬化患者，其冠狀動脈直徑較原動脈管徑或相鄰節(jié)段管徑≥1.5 倍，且未定位（＞20mm 長和/或包括動脈長度的1/3 以上）?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺狙芯揩@醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 miR-106b mimics、miR-NC 均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；GAPDH 抗體購于Cell Signaling Technology 公司；逆轉錄試劑盒Prime Script RT Rea-gent Kit、PCR 試劑盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit 購于TaRaKa 公司；VSMCs 細胞購自上海生物化學細胞生物學研究所；細胞和蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 等抗體購自Abcom 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 參考相關操作[2，9]，細胞在37℃、5%CO2含10%FBS、100U/ml 青霉素、100mg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分為4 組，未加任何處理為Control 組，加入1mmol/L Hcy 為Hcy 組，轉 染miR-NC 為Hcy+miR-NC 組，轉 染miR-106b mimics 為Hcy+miR-106b mimics 組。根據(jù)Lipofecta- mine 2000 說明書操作。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 提取細胞系的總RNA，操作步驟嚴格按照說明書進行。按照逆轉錄酶試劑盒說明書指導進行逆轉錄反應，得到cDNA，按照SYBR Prime Script miRNA RT-PCR 試劑盒說明，使用ABI Prism 7500 PCR 進行RNA 水平的測定。miR-106b上游引物序列為5'-TGCGGCAACACCAGTCGATGG -3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGG T-3'；GAPDH 上游引物序列為5'-TTGGTATCGTGG AAGGACTCA-3'，下游引物序列為5'-TGCGGCAA- 3'。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 MTT 實驗 在細胞計數(shù)后，進行細胞培養(yǎng)24h，制備細胞懸液，選取0.1ml/孔細胞懸液接種于96 孔板，每培養(yǎng)24h 后，加入MTT 試劑，570nm 處測量吸光值。實驗重復3 次。

1.2.4 Wound healing 實驗 把細胞接種到6 孔板中， 5%CO2孵育過夜，首先用記號筆在每孔的背面做好標記，以確定位置，用PBS 緩沖液沖洗細胞孔，把懸浮細胞去除，加入培養(yǎng)基后，5%CO2孵育。顯微鏡下拍照，測量劃痕的距離并記錄，實驗重復3 次。

1.2.5 Western blot 檢測 制備蛋白樣本，SDS-PAGE電泳，結束后進行轉膜操作，將凝膠中的目的蛋白轉移到PVDF 膜上。用PBS 緩沖液沖洗PVDF 膜，分別進行一抗孵育，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次2min，進行二抗孵育，再充分洗滌3 次，每次2min，進行顯色，計算蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用±s表示，采用t檢驗比較及單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-106b 在動脈粥樣硬化患者血清和細胞中的表達qRT-PCR 檢測結果顯示，與對照組相比，miR-106b 在動脈粥樣硬化患者血清中呈低表達（P＜0.01），見圖1；同時，miR-106b 在Hcy（1mmol/L） 誘導的VSMCs 中表達下調，而在轉染miR-106b 的VSMCs 中呈高表達（P＜0.01），見圖2。

2.2 miR-106b 對VSMCs 細胞增殖和遷移的影響MTT 實驗結果顯示，適當濃度Hcy 能夠誘導VSMCs的增殖活力；與轉染miR-NC 相比，轉染miR-106b mimics 細胞的增殖能力顯著被抑制（P＜0.05），見圖3；同時，Wound healing 實驗表明通過轉染miR-106b mimics 過表達細胞遷移率降低，細胞的遷移能力受到抑制（P＜0.05），見圖4。

2.3 miR-106b 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響Western blot 結果顯示，Hcy 可以增加PI3K、Akt 和mTOR 蛋白含量；同時，與miR-NC 比較，PI3K、Akt、mTOR 表達量在轉染miR-106b mimics 的Hcy 誘導VSMCs 細胞中明顯下調（P＜0.05），見圖5。

圖1 qRT-PCR 檢測患病組和對照組血清樣本中 miR-106b 相對表達量

圖2 qRT-PCR 檢測不同細胞中miR-106b 相對表達量

圖3 MTT 檢測不同細胞的增殖情況

圖4 Wound healing 檢測不同細胞的遷移情況

圖5 Western blot 檢測PI3K/Akt/mTOR 蛋白的表達情況

3 討論

動脈粥樣硬化在心血管疾病中最常見，該疾病涉及多種細胞因子參與，與脂質代謝、內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞活動及血小板活化有關。其中VSMCs 的增殖、遷移及侵襲是動脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件，活化VSMCs 促進動脈粥樣硬化斑塊的進展和最終的破裂[16]。所以迫切需要有效的治療靶點來降低動脈粥樣硬化的發(fā)生率。有研究顯示[17]，miRNA 可能通過促進相關靶mRNA 的降解及（或）抑制翻譯在轉錄后水平調節(jié)細胞的侵襲與轉移過程。因此，本研究探討miR-106b 在動脈粥樣硬化患者中的表達及其通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路對VSMCs 細胞增殖和遷移的影響。

microRNA 在轉錄后水平調控基因的表達，其在包含心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關重要的作用。研究表明，多種microRNA在心腦血管疾病中扮演著重要角色，包括miR-590、miR-98、miR-22、miR-365、miR-let-7c 等[17，18]。 miR-106b 與多種疾病的發(fā)生相關，包括卵巢癌、癲癇、阿爾茲海默癥等。低表達miR-106b 可以作為阿爾茲海默癥的潛在標志物。miR-106b 上調可抑制ox-LDL 誘導的動脈粥樣硬化內皮細胞凋亡。本研究結果顯示，miR-106b 在動脈粥樣硬化患者血清和Hcy 誘導的VSMCs 細胞中呈低表達，且轉染miR-106b mimics 后，Hcy 誘導的VSMCs 細胞增殖及遷移能力均顯著受到抑制，提示miR-106b 在動脈粥樣硬化中可能扮演抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路在細胞分化、生長中廣泛參與，是重要的調控因子，研究證實該通路與動脈粥樣硬化疾病密切相關[19，20]。研究表明，Akt/mTOR 信號通路的選擇性抑制可通過激活巨噬細胞抑制動脈粥樣硬化的進展，提高動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[21]。LncRNA ENST00113 在動脈粥樣硬化中通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號通路實現(xiàn)抑制增殖、遷移。在動脈粥樣硬化中氧化性低密度脂蛋白通過PI3K/Akt 激活mTOR，是平滑肌細胞增殖所必須的。本研究通過分析miR-106b 在動脈粥樣硬化中的表達，觀察其對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的影響，結果顯示，與miR-NC 比較，PI3K、Akt、mTOR 表達量在轉染miR106b mimics 的Hcy 誘導VSMCs 中下調，證明Hcy 誘導的VSMCs 細胞增殖及侵襲可能與PI3K/Akt/mTOR 通路相關。

綜上所述，miR-106b 在動脈粥樣硬化中呈低表達，并且通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制Hcy誘導的VSMCs 細胞增殖和遷移。本研究結果為后續(xù)相關機制研究提供參考，為治療動脈粥樣硬化提供了一個可能的潛在靶點。