章能勝，陳曉玲，胡豐林

1(安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系，安徽 池州，247099)2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，微生物防治省重點實驗室，安徽 合肥，230036)

蟲生真菌因具有特異的殺蟲作用，并且與昆蟲長期協(xié)同進化[1]，已成為生物防治的重要材料[2-3]，也是寶貴的藥用資源，如冬蟲夏草、蟬花等[4-6]。古尼蟲草[Cordycepsgunnii(Berk.)Berk. ]是寄生于蝙蝠蛾幼蟲的一種蟲草[7]，其藥用作用與冬蟲夏草生藥相當(dāng)，古尼擬青霉(PaecilomycesgunniiLiang)為古尼蟲草的無性型[8]。近年來，對古尼擬青霉液體發(fā)酵活性成分[9]和藥理作用[10-13]的研究較多，但對其固體培養(yǎng)物研究較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)古尼擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)物有較強的抗氧化活性。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上對古尼擬青霉產(chǎn)抗氧化活性成分進行分離純化與鑒定，為規(guī)?；a(chǎn)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

古尼擬青霉，采自安徽省金寨縣，分離于蝙蝠蛾科幼蟲，菌株編號為RCEF4117，由安徽省微生物防治重點實驗室提供(菌庫國際微生物數(shù)據(jù)中心登記號為WDCM No.1031)。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉10 g，瓊脂20 g，配制好后用蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 儀器與設(shè)備

6210 TOF高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀(liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS)，美國安捷倫公司；SPD-M20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Atlantis dC18(5 μm，3.9 mm×150 mm)分析型色譜柱、Atlantis dC18(5 μm，10 mm×150 mm)半制備型色譜柱，美國沃特世公司；Spectra Max M2酶標(biāo)儀，美國Molecular device公司；LRT-250G光照培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；分析級甲醇，上海建信化工有限公司；色譜級甲醇，美國天地(Tedia)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

按照1.1.2配制好培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌20 min后待冷卻至55 ℃左右倒培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基完全冷卻凝固，將剪好的玻璃紙(已滅菌)平鋪覆蓋在培養(yǎng)基上方，用移液器接種1 mL種子液于玻璃紙表面，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 ℃，時間為8 d，培養(yǎng)好后刮取玻璃紙上方的菌絲冷凍干燥備用。將凍干菌絲粉碎，稱取古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲凍干粉100 g，按照料液比1∶30(g∶mL)加入甲醇，超聲波浸提30 min，提取功率為80 kHz，提取溫度為40 ℃。提取液經(jīng)真空濃縮凍干后備用。

1.2.2 抗氧化活性測定

本研究采用二苯代苦味肼基(1,1-dipheny1-2-picrylhyldrazyl，DPPH)自由基法測定自由基清除率來表示抗氧化活性，具體選擇了測定抗氧化活性較方便快捷的酶標(biāo)儀實驗法(DPPH-Microplate)[14-16]和薄層色譜實驗法(DPPH-thin layer chromatography，DPPH-TLC)[17]。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ap，樣品加入DPPH試液的吸光值；Ac，樣品不加入DPPH試液的吸光值；Am，不加樣品(以100%甲醇代替)DPPH試液的吸光值。

1.2.3 LC/MS條件

MS條件：ESI離子源，霧化氣壓為35 Psi，液相色譜到質(zhì)譜的分流比為4∶1，氮氣流速12 L/min；陽離子下離子化電壓為4 000 V，碎片電壓250 V，陰離子下離子化電壓為3 500 V，碎片電壓175 V。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)洗脫條件：流動相A為甲醇，B為水；洗脫速度為0.8 mL/min；檢測波長為200～600 nm全波長掃描；梯度洗脫程序如表1所示。

1.2.4 高效液相制備色譜條件

制備用反相高效液相色譜條件：流動相A為甲醇，B為水；洗脫速度為3.5 mL/min；檢測波長為254 nm；梯度洗脫程序如表1所示。

表1 HPLC梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲抗氧化活性的測定

精確稱取30 mg古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲凍干粉放入1.5 mL離心管中，加 1 mL甲醇，超聲波浸提30 min，靜置24 h，離心后取上清液。按DPPH-TLC法進行清除自由基活性的定性試驗，薄層色譜圖(圖1)中可見多條黃色色帶(DPPH為穩(wěn)定的自由基，能與自由基清除劑反應(yīng)使吸收光發(fā)生藍移顯黃色)[18]。分別取100 μL上清液和100 μL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL DPPH試液于96孔酶標(biāo)板中，混勻振蕩30 s，常溫靜置20 min后于517 nm波長下測定其吸光值(Ap)。同時測定上清液不加入DPPH試液的吸光值(Ac)和加0.2 mg/mL DPPH試液但不加上清液(以同體積100%甲醇代替)的吸光值(Am)。按1.2.2中公式(1)測得其自由基清除率高達95%。結(jié)果顯示古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲中存在著較強自由基清除能力的活性成分。

圖1 古尼擬青霉甲醇提取物DPPH薄層色譜圖

2.2 活性組分的分離純化

2.2.1 提取物活性成分分析

將20 mg/mL的樣品甲醇提取物進樣20 μL進行液質(zhì)聯(lián)用分析，同時用1.5 mL離心管收集分流物，按1 min每管的速度收集，然后用氮氣吹干，加70 μL甲醇溶解，按DPPH-Microplate法測定每管的自由基清除率，找出相應(yīng)的活性組分。

由圖2可知，樣品中清除自由基活性組分主要集中在2個時間段，即10～13 min和15～17 min收集的流分，分別對應(yīng)著HPLC色譜圖(圖3)中保留時間為10.8 min和15.8 min的2個峰，MS色譜圖(圖4)中保留時間為11.2 min和16.2 min的2個離子流峰?？梢猿醪脚袛鄻悠分泻?個活性組分。

圖2 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC流分活性

圖3 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC圖譜

a-陰離子流圖譜；b-陽離子流圖譜圖4 古尼擬青霉HPLC-MS的離子流圖譜

2.2.2 提取物中活性組分分離制備

將20 mg/mL的樣品甲醇提取物進樣500 μL，利用反相高效液相色譜分離制備上述2個活性組分。從提取物的HPLC制備圖譜(圖5)中可以看出，應(yīng)重點收集峰A和峰B，同時也收集其他峰，以備做進一步研究。收集得到的峰A、峰B流分分別記為PG-1、PG-2。重復(fù)進樣20次，合并對應(yīng)的目標(biāo)組分，將收集到的PG-1、PG-2于低溫真空濃縮后凍干，分別得到目標(biāo)化合物21 mg和12 mg。

圖5 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC制備圖譜

2.3 活性分析和純度鑒定

2.3.1 活性分析

精確稱取10 mg PG-1溶解于1 mL甲醇中，取70 μL PG-1甲醇溶解液和70 μL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL DPPH試液加入384孔酶標(biāo)板中混勻，按照DPPH-Microplate法于517 nm下測定其吸光值，計算PG-1的清除自由基活性的平均值，對其進行活性定量分析確認(rèn)。PG-2的活性定量分析確認(rèn)方法同PG-1。結(jié)果顯示目標(biāo)化合物PG-1和PG-2清除自由基活性仍較強，自由基清除率分別達89.62%和75.45%。同時用DPPH-TLC法進行活性定性確認(rèn)，顯示制備的PG-1和PG-2在接觸DPPH試劑后均顯現(xiàn)出黃色斑點。定量和定性分析結(jié)果均表示制備過程中活性未丟失。

2.3.2 純度鑒定

用HPLC對活性成分進行純度鑒定，由圖6可知，在254 nm條件下，活性組分PG-1和PG-2均僅有1個色譜峰，且其峰前、中、后3段的紫外-可見光吸收譜相同，并與制備前提取物HPLC-MS分析結(jié)果一致，說明制備的組分中無紫外可見光吸收的雜質(zhì)，可初步判斷活性組分PG-1和PG-2均為純品。同時，采用HPLC峰面積歸一化法，計算分離到的PG-1和PG-2純度分別為97.31%和97.12%。

a-活性組分PG-1 HPLC色譜圖；b-活性組分PG-2HPLC色譜圖圖6 活性組分HPLC色譜圖

2.4 質(zhì)譜分析

a-活性組分PG-1陽離子質(zhì)譜圖；b-活性組分PG-1陰離子質(zhì)譜圖圖7 活性組分PG-1的高分辨質(zhì)譜圖

a-活性組分PG-2陽離子質(zhì)譜圖；b-活性組分PG-2陰離子質(zhì)譜圖圖8 活性組分PG-2的高分辨質(zhì)譜圖

由于組分PG-1和組分PG-2純品的質(zhì)荷比與分離純化前一致，確認(rèn)制備出的2種化合物為古尼擬青霉固體培養(yǎng)物中存在的天然化合物。通過從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中查詢，發(fā)現(xiàn)2種化合物為首次從古尼擬青霉中分離出。

3 討論與結(jié)論

蟲生真菌天然活性物質(zhì)常用的分離純化方法有：柱色譜法[19-20]、薄層色譜法[21]和高速逆流色譜法[22]等，本研究利用制備型HPLC對古尼擬青霉固體培養(yǎng)物抗氧化活性組分進行分離純化，得到2種純度較高的抗氧化活性物質(zhì)，并驗證了分離純化過程中目標(biāo)組分的抗氧化活性未丟失。本研究還利用高分辨HPLC-MS對古尼擬青霉固體培養(yǎng)物產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)進行分析，為找出目標(biāo)組分的分離制備條件，結(jié)合高分辨質(zhì)譜能快速確定活性物的種類與性質(zhì)。此方法適合用于活性強、含量高，有可能為未知化合物的研究[23-24]。若將各活性組分成功分離純化，同時確定其結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，會為進一步研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。