王恒震，李化強(qiáng)，吳菲菲，陳瓊，張?jiān)缑?，劉慶

(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院, 湖南 邵陽，422000)

果膠是存在于高等植物的原代細(xì)胞壁和中間薄片中的多糖，主要由線性骨架組成，主要成分是部分甲酯化的α-1,4-D-聚半乳糖醛酸[1-2]。降解柑橘囊衣所用到的酶有果膠酶和纖維素酶[3]，聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶的一類，聚半乳糖醛酸酶的應(yīng)用十分廣泛，現(xiàn)已應(yīng)用于食品、飼料、廢水處理、造紙、紡織等行業(yè)[4]；在食品加工工業(yè)中，廣泛應(yīng)用在果蔬汁的加工、果酒釀造、去除果皮等行業(yè)[5-6]。食品加工生產(chǎn)過程中使用的聚半乳糖醛酸酶往往是通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生的，隨著果蔬行業(yè)的快速發(fā)展以及環(huán)保的推進(jìn)，果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開發(fā)成為工業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)，對于任何一種酶制劑來說都需要探究酶學(xué)性質(zhì)，才能發(fā)揮酶最大的使用價值。在前期的研究過程中課題組從臍橙果園土壤中篩選出了1株棘孢木霉[7-8]，相關(guān)的報道也說明棘孢木霉可應(yīng)用到食品領(lǐng)域[9-10]，通過研究發(fā)現(xiàn)它可以產(chǎn)出降解柑橘囊衣的酶，因此分析該菌種可能既產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶又產(chǎn)纖維素酶，而木霉菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的研究幾乎沒有，該菌種產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶對于降解柑橘囊衣的效果顯著，研究該酶的特性可以促進(jìn)果蔬行業(yè)的改革，減少環(huán)境的壓力，具有重要意義。

本文研究聚半乳糖醛酸酶的特性，對該酶進(jìn)行部分純化并研究其理化特性、分子質(zhì)量大小以及動力學(xué)等酶學(xué)性質(zhì)，以期為果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

棘孢木霉菌(Trichodermaasperelham)(14 636)，本實(shí)驗(yàn)室篩選保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

橘粉培養(yǎng)基(g/L)：橘皮粉9.12,NH4NO36.42、(NH4)2SO42.14、MgSO40.60、NaCl 1.00，KH2PO41.00，K2HPO41.00，去離子水1 000 mL[5]。

1.1.3 主要試劑

果膠，阿拉丁試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，生工生物工程股份有限公司；D-半乳糖醛酸，Sigma；海藻酸鈉、戊二醛、CaCl2、酒石酸鉀鈉等,永大化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

UV2900紫外分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SB-5200超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HZ85-2型磁力攪拌機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聚半乳糖醛酸酶粗酶液制備

將篩選活化的棘孢木霉于30 ℃、160 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱下培養(yǎng)72 h，經(jīng)過3800 r/min離心20 min后過0.22 μm濾膜后得粗酶液。

1.2.2 聚半乳糖醛酸酶活性的測定

(1)酶活測定：通過二硝基水楊酸法[11-12]測定聚半乳糖醛酸酶活性。聚半乳糖醛酸酶活力計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1,試驗(yàn)組 OD 值所對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上還原糖量；A2,對照組 OD 值所對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線上還原糖量；N,酶液稀釋倍數(shù)；3,測定酶活力時取了反應(yīng)液的1/3；t,反應(yīng)所需時間,h。

相對酶活計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

(2)蛋白含量測定：蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán) G250 法，并且以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品[13]。

1.2.3 聚半乳糖醛酸酶的純化

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測

以低分子質(zhì)量蛋白Marker為標(biāo)記，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測定聚半乳糖醛酸酶的分子質(zhì)量。另外用含有質(zhì)量濃度2.5 g/L果膠的凝膠進(jìn)行聚半乳糖醛酸酶活性檢測，用質(zhì)量濃度2 g/L的釕紅作為染液[15]。

1.2.5 溫度對聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

將聚半乳糖醛酸酶置于30～70 ℃的環(huán)境中，測定最佳反應(yīng)溫度，通過在30～70 ℃下水浴保溫1 h測定酶活，以確定聚半乳糖醛酸酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.6 pH對聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

將聚半乳糖醛酸酶置于pH 3～8的緩沖溶液中，以測定最佳反應(yīng)pH，通過在pH 3～8的緩沖溶液中水浴保溫1 h測定酶活，以確定聚半乳糖醛酸酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.7 緩沖液對聚半乳糖醛酸酶活性的影響

通過在pH 4.8和離子強(qiáng)度(50.0 mmol/L)恒定的乙酸乙酸鈉緩沖液、檸檬酸緩沖液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中分別進(jìn)行該酶活性測定，研究了不同緩沖液對聚半乳糖醛酸酶活性的影響。

1.2.8 聚半乳糖醛酸酶動力學(xué)參數(shù)的測定

通過在1～20 g/L不同底物質(zhì)量濃度、48 ℃和pH 4.8的條件下，測定了聚半乳糖醛酸酶的米氏常數(shù)(Km)和最大速度(Vmax)。用Lineweavereburk圖(1/[S]對1/[V])計(jì)算了聚半乳糖醛酸酶的Km值和Vmax值，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.2.9 底物特異性

在不同底物(包括果膠、木聚糖和羧甲基纖維素)的質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液中測定了聚環(huán)化酶的底物特異性。

1.2.10 金屬離子和表面活性劑對聚半乳糖酶活性的影響

在濃度為1 mmol/L金屬離子(1∶1)條件下，測定不同金屬離子(Co2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Li2+和Fe2+)對聚半乳糖醛酸酶活性的影響(以氯鹽的形式存在)。同時分析了100 mmol/L吐溫-80、Tritonx-100和十二烷基硫酸鈉(sodium docecyl sulfate，SDS)等不同表面活性劑對聚半乳糖醛酸酶活性的影響[16]。

1.2.11 聚半乳糖醛酸酶的貯藏穩(wěn)定性

在4 ℃和30 ℃的下放置30 d，每隔5 d測定1次酶活。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析軟件采用SPSS 17.0軟件分析顯著性差異；做圖采用Origin 2017軟件；所有的試驗(yàn)進(jìn)行3次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉半乳糖醛酸酶的部分純化分析

聚半乳糖醛酸酶的部分純化結(jié)果如表1所示，純化倍數(shù)達(dá)2.1倍，回收率達(dá)94.53%，隨著蛋白含量變低，比酶活變大，雜蛋白隨著分離純化的進(jìn)行被分離出去。

表1 棘孢木霉多聚半乳糖醛酸酶的部分純化結(jié)果

SDS-PAGE電泳圖以及活性檢測如圖1所示，計(jì)算得出分子質(zhì)量為50.46、34.21、31.66、29.29 kDa。通過活性檢測也證明具有降解活性的分子質(zhì)量為29.29～50.46 kDa。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測定的聚半乳糖醛酸酶其分子質(zhì)量范圍與其他學(xué)者研究的結(jié)果一致，如草酸青霉菌CZ 1028、枯草芽孢桿菌PB1和黑曲霉MTCC 3323產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶分子質(zhì)量分別為38、43.1、34、69 kDa[17-19]。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-部分純化的聚半乳糖醛酸酶；2-聚半乳糖醛酸酶的酶譜分析圖1 聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析和活性檢測

2.2 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響

由圖2-A得出聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)pH為4.0，pH向堿性方向遷移時酶活急劇下降，在pH 7.0時幾乎喪失了初始活性的65.0%，說明該酶屬酸性酶，結(jié)果與NITURE[20]相似。圖2-B表明，在pH 3.0～5.0保溫60 min仍保持80%的活性，穩(wěn)定性較好?；钚灾行陌被岬馁|(zhì)子化導(dǎo)致酶的天然結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的變化而影響酶活性[21-22]。與Sigma公司的商品酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)pH與商品酶相接近，但穩(wěn)定性上在pH為3和5時該酶酶活僅損失20%左右，而商品酶損失50%左右[23]。

A-pH對酶活性的影響；B-pH對酶穩(wěn)定性的影響圖2 pH對棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.3 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響

通過圖3-A觀察到，聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)溫度是40 ℃，但溫度的升高會使酶分子發(fā)生三維結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致酶變性失活[16]，這與真菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的行為幾乎是一致的[24-25]。圖3-B中酶在30～50 ℃下保溫60 min后，酶活性依然保持在80%以上，而在60～70 ℃保溫60 min后，酶活性下降了50%以上，說明該酶在30～50 ℃穩(wěn)定性較好。這可歸因于純化酶在高溫下的三級結(jié)構(gòu)的變性[26-27]。在與Sigma公司以及北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司的進(jìn)行比較，該酶的最適溫度為40 ℃，而商品酶是30 ℃，在溫度30 ℃時保持90%以上的活性說明該酶在高溫條件下仍能保持較好活性。在50～70 ℃商品酶酶活損失超過了80%，該酶的酶活損失小于60%，該酶在較高溫度下穩(wěn)定性較好[23,28]。

A-溫度對酶活性的影響；B-pH對酶穩(wěn)定性的影響圖3 溫度對棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.4 緩沖液對聚半乳糖醛酸酶活性的影響

酶與底物反應(yīng)取決于帶電分子的運(yùn)動，緩沖液的離子是將底物的帶電基團(tuán)與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合的重要標(biāo)準(zhǔn)。由圖4可知，乙酸緩沖液較適用于果膠與聚半乳糖醛酸酶的結(jié)合以及酶活性部位帶電基團(tuán)的移動。

圖4 不同緩沖液對棘孢木霉聚半乳糖酶活性的影響

2.5 底物特異性和動力學(xué)參數(shù)

由圖5-A可知，部分純化的聚半乳糖醛酸酶對果膠具有較高的特異性，而對羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)和木聚糖無酶活性；通過圖5-B計(jì)算聚半乳糖醛酸酶的米氏常數(shù)Km值為0.74 mg/mL，Vmax為3 100 μg/min。其測定結(jié)果與CHENG等[17]研究的草酸青霉菌產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的Km值1.27 mg/mL和SILVA等[29]研究的利迪鏈霉菌CZ1028產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的Km值(1.63 mg/mL)相比較表明棘孢木霉產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶與底物的親和能力較好。

A-底物特異性；B-動力學(xué)參數(shù)圖5 棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶的底物特異性及動力學(xué)參數(shù)

2.6 貯藏穩(wěn)定性

由圖6-A可知,聚半乳糖醛酸酶在4、30 ℃下儲存30 d后酶活保留率為初始酶活的70.0%以上，相比之下在4 ℃條件下貯藏性能較好。這就表明在4 ℃和30 ℃這樣一個寬泛溫度的環(huán)境下具有良好的貯存特性，可以大大節(jié)約了貯存的成本。NAWAZ等[30]在研究α-葡萄糖苷酶時也發(fā)現(xiàn)該酶游離狀態(tài)下在4、 30 ℃下儲存30 d其酶活也保持在70%左右。

在此基礎(chǔ)上還進(jìn)行了發(fā)酵液pH變化的測定，測定結(jié)果如圖6-B所示，表明在貯藏過程中發(fā)酵液的pH逐漸下降，但在4、30 ℃下兩者的pH相差并不大。更加驗(yàn)證了該酶在酸性的條件下可以發(fā)揮良好的酶活特性。

A-貯藏穩(wěn)定性；B-pH變化圖6 聚半乳糖酶在不同溫度下的貯藏穩(wěn)定性以及pH變化

2.7 金屬離子和表面活性劑對聚半乳糖酶活性的影響

由圖7-A可知，Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+對聚半乳糖醛酸酶有激活效果，其中Ca2+激活效果最好；而Co2+、Zn2+、Ba2+、Li+、Fe2+對聚半乳糖醛酸酶顯現(xiàn)抑制作用，其中Zn2+抑制性最強(qiáng)。這種抑制作用可歸因于羧基的“嵌段”，其可捕獲酶分子并因此阻止酶水解反應(yīng)的進(jìn)行[31]。由圖7-B可知，在表面活性劑中Tritonx-100明顯提高了酶的活性，而吐溫-80和SDS則抑制聚半乳糖醛酸酶的活性，約喪失37.8%和47.04%的活性。

A-金屬離子；B-表面活性劑圖7 金屬離子和表面活性劑對棘孢木霉聚半乳糖醛酸酶活性的影響

3 結(jié)論

本文以課題組篩得的Trichodermaasperelham(保藏號為 CGMCC No:14636) 所產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶為研究對象，結(jié)果表明該酶在乙酸乙酸鈉的緩沖溶液環(huán)境下酶活反應(yīng)較好，通過(NH4)2SO4沉淀和透析袋透析后獲得分子質(zhì)量在29.29～50.46 kDa的純化酶，該酶比酶活為257.41 U/mg，純化倍數(shù)為2.1倍。該酶的最適反應(yīng)pH為4，在pH 3.0～5.0保溫60 min其酶活仍保持80%以上，具有了良好的耐酸性；最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在30～50 ℃保溫60 min其酶活仍保留80%以上，熱穩(wěn)定性較好;并且該酶純化后對果膠具有較高的特異性；表面活性劑Tritonx-100和Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+金屬離子對該酶具有一定的激活作用；通過計(jì)算該酶的米氏常數(shù)Km值為0.74 mg/mL，Vmax為3 100 μg/min，與底物的親和力較好；并且本研究發(fā)現(xiàn)該酶的貯藏性能較好，在4、 30 ℃下儲存30 d其酶活也保持在70%左右,可為果蔬清潔加工領(lǐng)域新型酶制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。