馬冰濤，范恩帝，李澤霞，張煜行，張志民，郭亞偉，姜東明，陳葉福，肖冬光，郭學(xué)武,*

1(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津， 300457)2(天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津， 300457)3(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院， 天津， 300457)4(河北衡水老白干釀酒(集團(tuán))有限公司， 河北 衡水， 053000)

中國(guó)白酒歷史悠久，是世界六大蒸餾酒之一[1]，主要由水、乙醇和風(fēng)味成分組成，其中風(fēng)味成分占2%左右，不同香型白酒之間的差異主要表現(xiàn)在風(fēng)味成分的含量和組成上[2]。老白干香型位居十二香型之一，以香氣清雅、自然協(xié)調(diào)、綿柔醇和、回味悠長(zhǎng)的特點(diǎn)而聞名[3]。從風(fēng)味成分上來(lái)看，老白干酒中富含乙酸乙酯和乳酸乙酯，兩者比例高達(dá)1∶1.5～2，遠(yuǎn)高于其他香型白酒，正是得益于其獨(dú)特的釀造工藝和特殊的大曲微生物群落結(jié)構(gòu)[4]。因此，保證老白干酒品質(zhì)的穩(wěn)定不僅需要有成熟的釀造工藝，還需要有標(biāo)準(zhǔn)的大曲生產(chǎn)工藝和品質(zhì)穩(wěn)定的大曲，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、專(zhuān)業(yè)化制曲，是白酒產(chǎn)業(yè)工業(yè)化的必然趨勢(shì)[5]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)老白干酒的風(fēng)味成分[6-7]和主要釀造微生物[8-9]的研究已取得了較為突出的成果，幫助老白干酒完善了一套標(biāo)準(zhǔn)、科學(xué)、穩(wěn)定的釀造工藝，但對(duì)大曲的研究還停留在單一的微生物分離和特性研究上[8,10]，對(duì)大曲微生物群落與風(fēng)味成分之間的關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道，很難為解決大曲品質(zhì)的穩(wěn)定問(wèn)題提供有力幫助。

老白干大曲以小麥為原料，經(jīng)過(guò)加水潤(rùn)濕、粉碎后壓成塊狀，人為控制條件培育而成[11]，能為釀酒提供豐富的酶和微生物，是釀酒生產(chǎn)的糖化劑、發(fā)酵劑、酒化劑和生香劑，在后續(xù)釀酒過(guò)程中占據(jù)著重要的地位，其質(zhì)量直接關(guān)系到老白干酒的產(chǎn)量和質(zhì)量[12-14]。有研究表明，細(xì)菌可能是制曲過(guò)程中微生物演替的驅(qū)動(dòng)力[15]，大曲中的微生物不僅參與白酒生產(chǎn)主要代謝途徑，還能產(chǎn)生部分風(fēng)味成分或其前體物質(zhì)，豐富白酒中的風(fēng)味成分,對(duì)白酒中的風(fēng)味成分形成具有很大幫助[16-18]。因此有必要研究老白干大曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)及其與風(fēng)味成分的關(guān)系。目前，已有學(xué)者通過(guò)分析微生物與風(fēng)味成分的相關(guān)性確定了白酒的核心微生物群[19]，但在大曲這方面還未見(jiàn)應(yīng)用。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)老白干大曲中的微生物進(jìn)行測(cè)序，確定大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)跟蹤檢測(cè)大曲中風(fēng)味成分的變化，最后通過(guò)分析微生物與風(fēng)味成分之間的相關(guān)性來(lái)確定大曲中的核心微生物群，解析核心微生物群與風(fēng)味成分的關(guān)系，以期為后續(xù)強(qiáng)化大曲微生物的研究奠定基礎(chǔ),同時(shí)也能為大曲標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 大曲樣品采集

大曲樣品，采集自河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司大曲廠。春季開(kāi)始跟蹤取同一曲房曲架上相近位置的曲塊，分別取0、5、10、15、20、30(出房曲)、120 d(成品曲)7種，每種取2個(gè)共14個(gè)樣品，均采用相同方法進(jìn)行后續(xù)處理。曲塊在無(wú)菌環(huán)境粉碎，過(guò)40目篩。粉碎時(shí)為避免機(jī)器自身發(fā)熱導(dǎo)致?lián)p失樣品中的風(fēng)味成分，每3 s關(guān)閉1次機(jī)器，待冷卻后再次開(kāi)啟，循環(huán)4～5次即可。粉碎后的大曲采用四分法取樣，每個(gè)樣品取2份各50 g，一份置于-20 ℃用于風(fēng)味成分分析，一份置于-80 ℃用于微生物多樣性分析。

1.2 儀器與試劑

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、20 mL 頂空瓶，美國(guó)Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國(guó)Supelco公司；HJ-2A磁力加熱攪拌器，上海維誠(chéng)儀器有限公司；FA2004電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司。

色譜純標(biāo)準(zhǔn)品：癸酸乙酯(110-38-3)、己酸乙酯(123-66-0)、乙偶姻(513-86-0)、β-石竹烯(87-44-5)、(+)-香橙烯(489-39-4)、香葉基丙酮(3796-70-1)、α-石竹烯(6753-98-6)、香樹(shù)烯(25246-27-9)、正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸(64-19-7)、乙醛(75-07-0)、異戊醛(590-86-3)、愈創(chuàng)木酚(90-05-1)、苯酚(108-95-2)、苯乙醇(60-12-8)、乙酸乙酯(141-78-6)、丙酮(67-64-1)、正己醇(111-27-3)、辛醇(111-87-5)、異戊醇(123-51-3)、2,3-丁二醇(513-85-9)、3-辛醇(589-98-0)、川芎嗪(1124-11-4)，百靈威科技有限公司；NaCl (分析純)，天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3 風(fēng)味成分的檢測(cè)與鑒定

大曲中揮發(fā)性化合物的檢測(cè)使用頂空固相微萃取配合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，檢測(cè)方法參照王敏等[20]測(cè)定白酒中風(fēng)味物質(zhì)的方法，優(yōu)化部分參數(shù)而成。

1.3.1 色譜條件

HP-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱溫40 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至150 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至250 ℃保持3 min。注射模式：不分流進(jìn)樣；載氣：He(>99.999%)；載氣流量：1 mL/min，溶劑延遲12 min，解吸附8 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，電子倍增器電壓1 080 V，掃描范圍(m/z)35～350 u。質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST14(Agilent公司)。

1.3.3 萃取方法

10 g大曲水浴加熱浸提。提取溫度80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取時(shí)間1.5 h，料液比1∶15 (g∶mL)。在頂空瓶中加入5 mL大曲提取液和2.5 g NaCl，采用固相微萃取的方法，通過(guò)萃取頭水浴加熱萃取，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度60 ℃，平衡時(shí)間5 min，解吸附時(shí)間8 min。

1.3.4 保留指數(shù)測(cè)定

取0.1 μL正構(gòu)烷烴混標(biāo)，按照上述方法進(jìn)樣分析，記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和樣品各個(gè)色譜峰的保留時(shí)間，各揮發(fā)性化合物保留指數(shù)的計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:RI，揮發(fā)性化合物的保留指數(shù)；n，該化合物碳標(biāo)的原子數(shù)；RTx，該化合物的保留時(shí)間；RTn，碳數(shù)n正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；RTn+1，碳數(shù)n+1正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.4 微生物多樣性分析

1.4.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophorosis，SDS-PAGE)方法提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，New England Biolabs公司)和高效高保真酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。細(xì)菌所用引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)；真菌所用引物為ITS3F (5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)。

1.4.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物用20 g/L質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE質(zhì)量濃度為20 g/L的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。

1.4.3 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns(Thermofisher 公司)建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Ion S5TMXL(Thermofisher公司)上機(jī)測(cè)序。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw data)，存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(dirty data)，為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)(clean data)。然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類(lèi)和物種分類(lèi)分析。根據(jù)OTUs聚類(lèi)結(jié)果，對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性計(jì)算。對(duì)不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha多樣性分析指數(shù)(Shannon、Chao1、goods coverage)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5 風(fēng)味成分熱圖的繪制和聚類(lèi)分析

熱圖和聚類(lèi)分析可以明晰風(fēng)味成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，也可以看出各個(gè)樣本之間的相似度。使用MSD化學(xué)工作站處理氣質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)，得到風(fēng)味成分在各個(gè)樣本中的含量和種類(lèi)，再使用OmicShare云平臺(tái)(https://www.omicshare.com)對(duì)所有樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析和熱圖(heatmap)繪制。

1.6 核心微生物與風(fēng)味成分的關(guān)系確定

參考王鵬等[19]的方法，將檢測(cè)到的風(fēng)味成分和豐度前20的細(xì)菌屬和真菌屬作為變量，7個(gè)時(shí)間段檢測(cè)到的風(fēng)味成分含量和微生物含量(取平行樣品的均值)分別對(duì)應(yīng)每個(gè)變量，通過(guò)SPSS 24.0計(jì)算變量之間的Spearman 相關(guān)系數(shù)(ρ)，選取微生物與風(fēng)味成分之間系數(shù)絕對(duì)值>0.8且相關(guān)性顯著的部分作為研究微生物與風(fēng)味成分相關(guān)性的可視化對(duì)像。對(duì)于微生物之間的共現(xiàn)性分析，選取微生物之間系數(shù)絕對(duì)值>0.8且相關(guān)性顯著的部分作為可視化對(duì)像。使用Cytoscape 3.6.1對(duì)大曲微生物與風(fēng)味成分的相關(guān)性和微生物之間的相互關(guān)系進(jìn)行可視化圖形的繪制。

前二十的選?。哼x取7個(gè)時(shí)間段樣品豐度排名前2位的微生物共14個(gè)，繼續(xù)對(duì)比7個(gè)樣品豐度排名第3的微生物，選取豐度排名前6的微生物(如有相同微生物，則選取下一排名)。所有微生物豐度均是每個(gè)時(shí)間段平行樣品的平均值(前10方法同此)。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲過(guò)程中的微生物多樣性

對(duì)樣品測(cè)序后進(jìn)行嵌合體過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)(clean reads)。如表1所示，16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果共得到1 121 768條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣本具有(80 126±180)條；ITS結(jié)果共得到1 099 830條高質(zhì)量的序列，平均每個(gè)樣本具有(78 559±13 455)條。所有樣品覆蓋率均在0.990以上，說(shuō)明測(cè)序深度足夠深，得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量也科學(xué)可靠。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)

對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行α多樣性分析，可以明晰大曲微生物群落多樣性[21]。Shannon指數(shù)用來(lái)估算樣品中微生物的多樣性，值越大，說(shuō)明群落多樣性越高；Chao1指數(shù)是用Chao1算法估計(jì)群落中含OTU數(shù)目的指數(shù)，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)，值越大代表物種總數(shù)越多[22](均一化時(shí)選取的數(shù)據(jù)量為cutoff=44 218)。

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個(gè)分組在各分類(lèi)水平(phylum、genus)上最大豐度前10的物種，繪制物種相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)圖(圖1)，細(xì)菌門(mén)主要有藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)，其中藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)(93.91%)在0 d占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(64.12%～70.71%)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)(4.64%～19.55%)在5～10 d逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，15～30 d厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(17.95%～35.61%)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)(57.55%～74.12%)占優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)90 d的儲(chǔ)存期后，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(79.40%)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，放線菌門(mén)(Actinobacteria)(15.29%)次之；優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)主要有子囊菌門(mén)(Ascomycota)和毛霉門(mén)(Mucoromycota)。屬水平上，共檢測(cè)到78個(gè)細(xì)菌屬和54個(gè)真菌屬，其中細(xì)菌屬乳桿菌屬(Lactobacillus)(6.39%～45.90%)、魏斯氏菌屬(Weissella)(1.43%～25.69%)和真菌屬伊薩酵母屬(Issatchenkia)(7.59%～74.68%)、曲霉屬(Aspergillus)(7.25%～71.57%)在整個(gè)制曲過(guò)程中為優(yōu)勢(shì)菌屬。乳桿菌屬(Lactobacillus)在釀造過(guò)程中有著舉足輕重的地位，老白干酒含有遠(yuǎn)高于其他香型酒的乳酸乙酯就是得益于此[4]；魏斯氏菌屬(Weissella)對(duì)有機(jī)酸、酯類(lèi)及短鏈脂肪酸等風(fēng)味成分的合成具有重要作用，是參與食品發(fā)酵的重要微生物[23]。伊薩酵母屬(Issatchenkia)和曲霉屬(Aspergillus)是大曲中常見(jiàn)的兩種真菌，對(duì)合成醇類(lèi)、脂類(lèi)等物質(zhì)有較大幫助。unidentified_Cyanobacteria(93.79%)和鏈格孢屬(Alternaria)(48.46%)僅在0 d占優(yōu)勢(shì)，它們可能來(lái)自于原料，隨著制曲時(shí)間逐漸消散。鏈霉菌屬(Streptomyces)從15 d(1.31%)開(kāi)始出現(xiàn)，到20 d(48.30%)迅速增長(zhǎng)成為優(yōu)勢(shì)菌，之后逐漸減少。鏈霉菌屬(Streptomyces)具有很強(qiáng)的萜烯類(lèi)物質(zhì)合成能力，對(duì)白酒風(fēng)味具有很大貢獻(xiàn)[24]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，30 d 與120 d菌落結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大，因?yàn)?0 d以后，大曲會(huì)從曲房轉(zhuǎn)移到大曲倉(cāng)庫(kù)進(jìn)行90 d的存儲(chǔ)(老熟)過(guò)程，在此期間，大曲水分含量逐漸降低，且存儲(chǔ)環(huán)境(溫度、濕度)與曲房有較大差異，所以會(huì)導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。

a-門(mén)水平前10分布情況;b-屬水平前10分布情況

2.2 制曲過(guò)程中風(fēng)味成分的變化

通過(guò)頂空固相微萃取-氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)大曲中的風(fēng)味成分，并進(jìn)行半定量分析。如表2所示，共檢測(cè)到99種風(fēng)味成分，其中包含12種酯類(lèi)、11種酮類(lèi)、9種萜烯類(lèi)、5種碳?xì)浠衔铩?種酸類(lèi)、18種醛類(lèi)、4種酚類(lèi)、3種芳香類(lèi)、1種呋喃類(lèi)、16種醇類(lèi)、7種吡嗪類(lèi)、2種吡喃類(lèi)和2種吡啶類(lèi)。將檢測(cè)到的風(fēng)味成分繪制成熱圖(heatmap)，并對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)，結(jié)果顯示，風(fēng)味成分在制曲過(guò)程中的演變趨勢(shì)比較明顯，重要酯類(lèi)物質(zhì)(乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯等)主要在30～120 d的儲(chǔ)存過(guò)程中合成。而屬于健康因子的諸多萜烯類(lèi)物質(zhì)，則主要合成于5～15 d。吡嗪、吡啶、吡喃等物質(zhì)主要合成于10～15 d。其他酸、醛、醇等白酒中常見(jiàn)物質(zhì)則在5～30 d合成。由此可知，5～15 d是制曲過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)高產(chǎn)期，30～120 d的儲(chǔ)存期則是重要酯類(lèi)物質(zhì)的合成期。

表2 大曲中的風(fēng)味成分

續(xù)表2

續(xù)表2

圖2 制曲過(guò)程中風(fēng)味成分的變化熱圖

2.3 核心微生物的確定及其與風(fēng)味成分的關(guān)系

通過(guò)計(jì)算微生物與風(fēng)味成分之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，選擇符合要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。由圖3可知，芽孢桿菌屬(Virgibacillus)是連接數(shù)最大的一個(gè)屬(6個(gè)，包含4個(gè)正相關(guān)2個(gè)負(fù)相關(guān))，屬于芽孢桿菌目，其代謝產(chǎn)物包含一些白酒中的微量物質(zhì)(如乳酸[25])，對(duì)白酒風(fēng)味有一定影響，是白酒釀造過(guò)程中的重要微生物[26-27]。unidentified_Cyanobacteria、

絲孢酵母屬(Trichosporon)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、假絲酵母屬(Candida)和海洋桿菌屬(Oceanobacillus)連接數(shù)也相對(duì)較多，與醇、酸、酮、酯類(lèi)化合物有顯著的相關(guān)性。證明在制曲過(guò)程中，對(duì)風(fēng)味成分影響較大的微生物屬是芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、unidentified_Cyanobacteria、絲孢酵母屬(Trichosporon)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、假絲酵母屬(Candida)和海洋桿菌屬(Oceanobacillus)。

為探究微生物彼此之間的相互作用關(guān)系，計(jì)算微生物之間的Spearman相關(guān)系數(shù)，選擇符合要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析圖的繪制(圖4)。共得到39個(gè)有效節(jié)點(diǎn)(nodes)和204個(gè)邊(edges)。連接數(shù)較多的菌屬包括小球菌屬(Pediococcus)、枝孢屬(Cladosporium)、赤霉菌屬(Gibberella)、匐柄霉屬(Stemphylium)、鏈格孢屬(Alternaria)、附球菌屬(Epicoccum)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、Saccharomycopsis、絲孢酵母屬(Trichosporon)、unidentified_Cyanobacteria、鐮刀菌屬(Fusarium)、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、邁勒吉爾霉菌屬(Melghirimyces)、假絲酵母屬(Candida)、青霉菌屬(Penicillium)、泛菌屬(Pantoea)和Kosakonia，大多數(shù)分布在芽孢桿菌目(Bacillales)、格孢菌目(Pleosporales)、乳桿菌目(Lactobacillales)和酵母目(Saccharomycetales)4個(gè)目中。其中，小球菌屬(Pediococcus)具有最多的連接數(shù)(9個(gè))，且有5個(gè)菌與其具有顯著的負(fù)相關(guān)性。結(jié)合圖2分析可知，對(duì)風(fēng)味成分貢獻(xiàn)較大的核心微生物屬包括芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、unidentified_Cyanobacteria、絲孢酵母屬(Trichosporon)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、假絲酵母屬(Candida)。

圖4 大曲中微生物之間的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)檢測(cè)到的風(fēng)味成分和豐度前20的微生物分別進(jìn)行主成分分析，通過(guò)提取微生物和風(fēng)味成分的第1主成分進(jìn)行相關(guān)性分析，可以驗(yàn)證所得核心微生物群是否對(duì)風(fēng)味成分有較大貢獻(xiàn)[19]。如圖5所示，上述所得核心微生物群與風(fēng)味成分具有顯著相關(guān)性(R2=0.636 8，P<0.05)，說(shuō)明本次研究所得的6種微生物屬所組成的核心微生物群對(duì)大曲風(fēng)味成分有較大影響，是制曲過(guò)程中的重要微生物，同時(shí)也為后續(xù)白酒釀造提供了豐富的風(fēng)味成分和前體物質(zhì)，對(duì)白酒形成獨(dú)特風(fēng)味有重大貢獻(xiàn)。

圖5 微生物第1主成分與風(fēng)味成分第1主成分的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

白酒發(fā)酵作為多微共酵發(fā)酵方式的典型代表，具有參與微生物種類(lèi)多、工藝復(fù)雜和不易控制等特點(diǎn)。而作為影響白酒質(zhì)量關(guān)鍵因素的大曲同樣具有復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)，大曲微生物的研究是近年來(lái)白酒研究的熱點(diǎn)之一，其對(duì)于大曲現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)具有非常重要的意義。

本研究通過(guò)對(duì)老白干大曲樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共檢測(cè)到78個(gè)細(xì)菌屬和54個(gè)真菌屬，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和鏈霉菌屬(Streptomyces)，優(yōu)勢(shì)真菌屬為伊薩酵母屬(Issatchenkia)和曲霉屬(Aspergillus)。氣質(zhì)分析結(jié)果可知，老白干香型大曲中除酯類(lèi)、醇類(lèi)和酸類(lèi)等常見(jiàn)物質(zhì)外，萜烯類(lèi)和吡嗪類(lèi)物質(zhì)也較為豐富(表2)。醬香型大曲中風(fēng)味成分主要是酸類(lèi)、芳香族、醇類(lèi)及酯類(lèi)[28]，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要包括由芽孢桿菌目(Bacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、乳酸桿菌目(Lactobacillales)和放線菌目(Actinomycetales)4個(gè)目，優(yōu)勢(shì)真菌是酵母目(Saccharomycetales)、肉座菌目(Hypocreales)、散子囊菌目(Eurotiales)和絲孢酵母目(Trichosporonales)4個(gè)目[29]；濃香型大曲中的風(fēng)味成分主要是酸類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)和醛類(lèi)[30]，傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)鑒定得到的優(yōu)勢(shì)菌為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、謝瓦氏曲霉(Aspergilluschevalieri)、米曲霉(Aspergillusoryzae)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變形梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)鑒定得到的優(yōu)勢(shì)菌為葡萄球菌(Staphylococcus)、高溫放線菌(Thermoactinomyces)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、多枝橫梗霉(Lichtheimiaramose)[31]；清香型大曲中風(fēng)味成分比較突出的是醇類(lèi)和酮類(lèi)[32]，微生物主要組成為扣囊覆膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)、乳酸菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)[33]。由此可知，大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)大曲中的風(fēng)味成分有較大影響，不同香型白酒大曲中的微生物組成和風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)都不一樣。老白干香型大曲與其他主要香型大曲相比，有屬于自己獨(dú)特的核心微生物和風(fēng)味成分，這也是構(gòu)成老白干香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的主要因素之一。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，老白干大曲中并沒(méi)有檢測(cè)到乳酸乙酯和乙酸乙酯，這可能與檢測(cè)下限有關(guān)，也說(shuō)明了酒體中的這兩種風(fēng)味成分主要是在酒醅發(fā)酵過(guò)程中形成的。風(fēng)味物質(zhì)熱圖聚類(lèi)分析結(jié)果表明，5～15 d是制曲過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)高產(chǎn)期；30～120 d的儲(chǔ)存期則是重要酯類(lèi)物質(zhì)的合成期。根據(jù)相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖可知，芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、unidentified_Cyanobacteria、絲孢酵母屬(Trichosporon)、旋孢腔菌屬(Cochliobolus)、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、假絲酵母屬(Candida)6種微生物屬對(duì)風(fēng)味成分有較大貢獻(xiàn)，但其中只有unidentified_Cyanobacteria一種是優(yōu)勢(shì)菌屬(圖1)，這與之前王鵬等[19]報(bào)道的白酒發(fā)酵過(guò)程中的核心微生物群則大多數(shù)由豐度較大的菌屬組成并不是很一致。豐度較低的微生物也有可能對(duì)風(fēng)味物質(zhì)有較大的貢獻(xiàn)，比如在濃香型酒醅中，梭菌綱微生物豐度一直較低，但對(duì)酒醅風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)卻巨大[35]。因此，微生物豐度大小與其對(duì)風(fēng)味成分的貢獻(xiàn)之間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究，后續(xù)還要與該微生物關(guān)聯(lián)的風(fēng)味成分的閾值等相關(guān)因素關(guān)聯(lián)起來(lái)。

總之，通過(guò)研究制曲過(guò)程中微生物多樣性及其與風(fēng)味成分的關(guān)系，能夠進(jìn)一步了解大曲核心微生物對(duì)風(fēng)味成分的貢獻(xiàn)情況，同時(shí)可以結(jié)合微生物培養(yǎng)技術(shù)改良大曲生產(chǎn)工藝，彌補(bǔ)某類(lèi)微生物缺陷，為大曲標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供參考，也為下一步研究釀酒過(guò)程中的微生物多樣性以及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成過(guò)程奠定基礎(chǔ)。