●吳霖鋒 鮑明隆 邱春妙 廖華維 張繼東 劉曉曦

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院廣東湛江524000）

桉樹是一種優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)樹種，具有生長速度快、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)[1]。桉葉含有多種化學(xué)成分，主要包括桉葉精油、黃酮、有機(jī)酸等物質(zhì)[2]。其中桉葉有效成分精油具有抑菌、消炎、抗氧化等生理活性[3]。桉葉的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波提取法和微波提取法等，其中超聲提取法具有快速高效、保留有效活性成分等優(yōu)點(diǎn)[2]，值得深入研究。金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，常導(dǎo)致機(jī)體局部皮膚、組織、器官發(fā)生化膿性感染，甚至是中毒性休克[4]?？股厥强刂平瘘S色葡萄球菌感染的有效措施，但細(xì)菌耐藥性現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[5]。研究發(fā)現(xiàn)，桉葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用[6]，可作為抗生素的替代品。本實(shí)驗(yàn)以桉葉為原料，以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取桉葉抗菌成分的方法，以最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）評(píng)價(jià)桉葉提取物的抑菌、殺菌效果，最終確定超聲波提取桉葉抗菌成分的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象桉葉采摘于廣東海洋大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院種植的尾巨桉DH32-39。金黃色葡萄球菌（ATCC26112）由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑瓊脂培養(yǎng)基，由杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，由杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；無水乙醇，由上海珊億化工科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器多用途恒溫超聲提取機(jī)，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司（DCTZ-1000)；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（SPX-250B-Z型)；流線型支架粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司（DFY-1000C)；臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司（TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī))。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理將尾巨桉DH32-39樹葉置于通風(fēng)處陰干獲得飲片；用流線型支架粉碎機(jī)粉碎干燥的桉樹葉15s，獲得桉葉碎片；將粉碎的桉葉經(jīng)20目檢驗(yàn)篩均勻搖晃，獲得20目粒度桉葉，備用。

1.2.2 正交試驗(yàn)稱取10g桉葉（飲片、破碎、20目粒度）置于燒杯中，加入30mL的蒸餾水。正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間、超聲波功率及粒度3個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲提取桉葉。因素與水平設(shè)計(jì)，見表1。超聲后獲得的桉葉提取液，經(jīng)4層紗布過濾取濾液，離心機(jī)4 000r/min離心8min，過濾，加熱濃縮至10mL（藥液最終濃度為1g/mL)。121℃高壓蒸汽滅菌，4℃溫度條件下保存。

1.2.3 不同濃度乙醇作為提取溶劑的對(duì)比試驗(yàn)以

1.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化后的超聲波提取工藝獲得桉葉提取物。在此工藝條件基礎(chǔ)上，探討不同濃度（50%~100%）的乙醇對(duì)桉葉提取液抑菌、殺菌效果的作用。桉葉的處理：取10g桉葉置于燒杯中，分別加入30mL 50%~100%乙醇，以1.2.2正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝煎煮，離心，過濾，加熱濃縮至10mL。

1.2.4 菌液制備將金黃色葡萄球菌菌種和海豚鏈球菌菌種分別接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。用接種環(huán)蘸取適量菌液，在營養(yǎng)瓊脂平板中劃線培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落置于10mL無菌營養(yǎng)肉湯中，制成菌液。

1.2.5 桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)在無菌條件下，取無菌試管10支，第1管加1.6mL營養(yǎng)肉湯，第2~10管各加1mL營養(yǎng)肉湯。吸取桉葉提取液0.4mL（濃度為1g/mL）加入第1管中，混勻。在第1管中吸取1mL混合液加入第2管中，混勻。按此方式依次倍比稀釋至第10管。此時(shí)，1~10號(hào)管中桉葉提取液的濃度分別為200mg/mL、100 mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.563mg/mL、0.781mg/mL和0.391mg/mL。在試管中加入10L菌液，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。肉眼觀察試管內(nèi)液體情況，如液體澄清，說明試管內(nèi)無細(xì)菌生長，液體渾濁則說明試管內(nèi)有細(xì)菌生長。以無細(xì)菌生長的液體濃度記為桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.6 桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取1.2.5中1~10號(hào)管37℃培養(yǎng)24h后的菌液，接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。觀察結(jié)果，以營養(yǎng)瓊脂平板上無細(xì)菌生長的最低菌液濃度記為桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果

2.1 不同超聲提取工藝對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC影響的試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)超聲提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果，見表2。以水平組合A2B1C2超聲提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.781mg/mL，是9種水平組合中的最低值，說明該條件下獲得桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。其他條件下超聲提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC在3.13~100mg/mL之間。

表2桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

續(xù)表2

2.2 不同超聲提取工藝對(duì)于金黃色葡萄球菌的MBC影響的試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)超聲提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果，見表3。在水平組合A2B2C3條件下，超聲獲得的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為12.25mg/mL，為9種水平組合中的最低值，此時(shí)桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌效果最好。其他水平組合條件下超聲獲得的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC在25~50mg/mL之間。

表3桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

2.3 不同提取溶劑對(duì)于提取液抗菌、殺菌效果影響的試驗(yàn)結(jié)果

以蒸餾水對(duì)照，使用不同濃度的乙醇（50%~100%）作為提取溶劑，測(cè)定其提取液的MIC和MBC，結(jié)果見表4。蒸餾水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇以及90%乙醇的桉葉提取液的MIC均為1.6mg/mL，而100%乙醇的桉葉提取液的MIC為8mg/mL，蒸餾水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇的桉葉提取液的MBC均為40mg/mL，而90%和100%乙醇的桉葉提取液的MBC為8mg/mL，因此90%乙醇作為桉葉提取液的提取劑的效果最好，在選擇提取溶劑時(shí)應(yīng)使用90%乙醇。

表4桉葉乙醇超聲提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

3 討論與結(jié)論

桉樹作為一種我國南方重要的速生高產(chǎn)人工林樹品種[7]，其樹葉中含有大量的活性成分，包括桉葉精油、黃酮類、鞣質(zhì)、多酚等[8]。桉葉精油對(duì)于金黃色葡萄球菌有較好的滅殺效果[6]。桉葉活性成分的提取方式有很多，常見的包括溶劑提取法和超聲提取法，目前國內(nèi)應(yīng)用較多的為溶劑提取法，但超聲提取法相對(duì)于溶液提取法具有快速高效、可保留熱敏物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的特點(diǎn)[2]，本試驗(yàn)選擇以超聲提取法中不同提取時(shí)間、超聲功率、原料粒度以及不同溶劑為變量，以桉葉提取液對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC、MBC為衡量標(biāo)準(zhǔn)，嘗試優(yōu)化桉葉的超聲提取工藝。

正交試驗(yàn)中不同的提取時(shí)間、超聲功率、原料粒度的組合，會(huì)使桉葉提取液對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC產(chǎn)生明顯差異，MIC處于0.781~100mg/mL之間。其中A2B1C2超聲工藝提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.781mg/mL，為所有數(shù)值中的最低值。同時(shí)通過極差分析可知，各因素影響金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的順序?yàn)椋褐兴幜６龋–）>超聲功率（B）>時(shí)間（A），見表2。在正交試驗(yàn)中不同的提取時(shí)間、超聲功率、原料粒度的組合會(huì)造成桉葉提取液對(duì)于金黃色葡萄球菌的MBC存在明顯差異，MBC處于12.25~50mg/mL之間。其中A2B2C3超聲工藝提取的桉葉提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC為12.25mg/mL，為所有數(shù)值中的最低值。通過極差分析可知，各因素影響金黃色葡萄球菌最小殺菌濃度的順序?yàn)椋褐兴幜６龋–）>時(shí)間（A）>超聲功率（B），見表3。

綜合分析正交試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，中藥粒度是最大的影響因素，顆粒細(xì)化程度最高的是20目粒度，故將粒度確定為20目。正交試驗(yàn)結(jié)果顯示提取時(shí)間在2水平為最佳，時(shí)間確定為10min。在超聲功率的3個(gè)水平中，正交試驗(yàn)MIC結(jié)果顯示，在B因素中1水平結(jié)果最差；正交試驗(yàn)MBC的結(jié)果顯示，在B因素中3水平的結(jié)果最差，所以B因素中的1水平和3水平都不是最優(yōu)的選項(xiàng)，故選取2水平的超聲功率480W。所以桉樹葉的最佳提取工藝可以確定為：桉葉粒度20目、超聲波功率480W條件下超聲10min。考慮到提取溶劑會(huì)對(duì)桉葉提取物的抗菌殺菌能力產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)以蒸餾水為參照，探討不同濃度的乙醇（50%~100%）桉葉提取物抑制、殺滅金黃色葡萄球菌的能力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高濃度的乙醇（90%~100%）桉葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MBC由40mg/mL降至8mg/mL，表明較高濃度的乙醇（90%~100%）增強(qiáng)了尾巨桉DH32-29桉葉殺滅金黃色葡萄球菌的能力，而以90%乙醇為溶劑的桉葉提取液的MIC和MBC數(shù)值最小，說明此時(shí)桉葉提取液抑制、殺滅金黃色葡萄球菌的能力最強(qiáng)，效果最好。

最終結(jié)論，尾巨桉DH32-39桉葉最佳超聲提取工藝為：90%乙醇作為提取溶劑，桉葉粒度20目，超聲波功率480W條件下超聲10min。