黃勇 王靜 鮑廣建 倫增軍 褚朋 支良

【摘要】 目的 探討胃癌組織中星形細胞上調(diào)基因-1（AEG-1）、人表皮生長因子受體-2（HER2）的表達情況及其與胃癌臨床病理特征的相關性。方法 47例胃癌患者為研究對象， 另隨機選取其中18例，取距腫瘤5 cm以上的癌旁胃組織作為對照組。采用免疫組織化學方法、反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及熒光原位雜交技術（FISH）檢測所有患者AEG-1、HER2表達情況。比較胃癌組織及癌旁胃組織中AEG-1、HER2、AEG-1 mRNA表達情況;分析胃癌組織中HER2基因擴增情況;胃癌組織中AEG-1、HER2的表達與臨床病理特征的關系;分析在胃癌組織中AEG-1 mRNA表達與HER2基因擴增表達， AEG-1表達與HER2表達的相關性。結果 AEG-1在胃癌組織中的陽性表達率為74.47%（35/47）， 明顯高于癌旁胃組織的0;HER2在胃癌組織中的陽性表達率為38.30%（18/47）， 明顯高于癌旁胃組織的0， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。采用FISH技術檢測到胃癌組織中HER2基因擴增9例， HER2基因擴增率為19.15%（9/47）。RT-PCR檢測胃癌組織中AEG-1 mRNA表達水平（0.702±0.123）顯著高于癌旁胃組織的（0.244±0.111）， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。胃癌組織中不同分化程度、TNM分期及淋巴結轉移患者的AEG-1 mRNA表達陽性情況比較， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 分化程度越低、TNM分期越晚、有淋巴結轉移， 其陽性表達越高。胃癌組織中不同分化程度患者的HER2基因擴增情況比較， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 分化程度越高， 其基因擴增率越高。胃癌組織中AEG-1 mRNA表達與HER2基因擴增無相關性（P>0.05）。胃癌組織中免疫組化AEG-1表達與HER2表達呈正相關（r=0.361， P=0.033<0.05）。結論 胃癌組織中可能存在AEG-1、HER2信號通路， 檢測胃癌組織中AEG-1、HER2的表達， 有助于判斷胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移。

【關鍵詞】 星形細胞上調(diào)基因-1;人表皮生長因子受體-2;胃癌;病理學特征

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.22.002

The expression of AEG-1 and HER2 in gastric cancer tissue and its correlation with clinical-pathological features? ?HUANG Yong， WANG Jing， BAO Guang-jian， et al. Department of General Surgery， Zaozhuang Municipal Hospital， Zaozhuang 277100， China

【Abstract】 Objective? ?To discuss the expression of astrocyte elevated gene-1 （AEG-1） and human epidermal growth factor receptor2 （HER2） in gastric cancer tissue and its correlation with clinical-pathological features. Methods? ?There were 47 cases of gastric cancer as study subjects， of which 18 cases were randomly selected， and the adjacent gastric tissues more than 5 cm from the tumor were used as the control group. The expression of AEG-1 and HER2 was detected by immunohistochemistry， reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） and fluorescence in situ hybridization （FISH）. The expression of AEG-1， HER2， AEG-1 mRNA expression in gastric cancer tissues and adjacent gastric cancer tissues was compared. HER2 gene amplification in gastric cancer tissues， and the correlation between the expression of AEG-1 and HER2 in gastric cancer tissues and clinical-pathological features was analyzed. The correlation between AEG-1 mRNA expression and HER2 gene amplification expression， AEG-1 expression and HER2 expression in gastric cancer tissues was analyzed. Results? ?The positive expression rate of AEG-1 in gastric cancer tissue was 74.47% （35/47）， which was significantly higher than that of tissue adjacent to gastric cancer 0. The positive expression rate of HER2 in gastric cancer tissue was 38.30%（18/47）， which was significantly higher than that of tissue adjacent to gastric cancer 0， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There were 9 cases of HER2 gene amplification in gastric cancer tissues detected by FISH technique， and the HER2 gene amplification rate was 19.15% （9/47）. According to RT-PCR， the expression of AEG-1 mRNA （0.702±0.123） in gastric cancer tissues was significantly higher than that in tissues adjacent to gastric cancer （0.244±0.111）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the positive expression of AEG-1mRNA in patients with different degrees of differentiation， TNM stages and lymph node metastasis in gastric cancer tissues， the differences were statistically significant （P<0.05）. The lower the degree of differentiation， the later the TNM stage and the lymph node metastasis， the higher the positive expression. Comparison of HER2 gene amplification in patients with different degrees of differentiation in gastric cancer tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. The higher the differentiation degree， the higher the gene amplification rate. There was no correlation between AEG-1 mRNA expression and HER2 gene amplification in gastric cancer tissues （P>0.05）. The expression of immunohistochemical AEG-1 was positively correlated with the expression of HER2 in gastric cancer tissue， and the difference was statistically significant （r=0.361， P=0.033<0.05）. Conclusion? ?There may be AEG-1 and HER2 signaling pathway in gastric cancer tissue. Detecting the expression of AEG-1 and HER2 in gastric cancer tissues helps judgment the occurrence， development， invasion and metastasis of gastric cancer.

【Key words】 Astrocyte elevated gene-1; Human epidermal growth factor receptor-2; Gastric cancer; Pathological features

我國胃癌有早期胃癌約占10%、進展期病例較多、發(fā)病率和病死率高等特點[1]。星形細胞上調(diào)基因-1（astrocyte elevated gene-1， AEG-1）， 即異粘蛋白（metadherin， MTDH）， 當前不僅成為多種惡性腫瘤潛在的關鍵調(diào)節(jié)基因， 還是復雜癌基因信號通路的關鍵交匯點[2]。HER2是表皮生長因子受體家族中的成員， 既往研究表明HER2 在多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起作用[3]。2010年ToGA試驗[4]采用曲妥珠單抗聯(lián)合化療治療提高了HER2 陽性的晚期胃癌和胃食管連接部腺癌患者的生存期。胃癌組織中AEG-1表達情況的相關研究不多[5-7]， 國內(nèi)外AEG-1、HER2在胃癌組織中表達及其信號通路的研究很少見。本研究應用免疫組織化學方法、RT-PCR及FISH檢測AEG-1、HER2在胃癌組織中表達及其與胃癌臨床病理特征的相關性， 探討AEG-1與HER2在胃癌組織中表達的相關性。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2018年5月～2019年11月在山東省棗莊市立醫(yī)院普通外科住院手術， 并且術后病理證實為胃癌患者47例為研究對象。男25例， 女22例;年齡32～78歲;高及中分化腺癌19例、低及未分化腺癌28例;依據(jù)TNM分期（2018年AJCC胃癌TNM分期， 第8版）其中Ⅰ期及Ⅱ期17例、Ⅲ期30例。入選患者術前均未接受化療或放療， 均排除其他腫瘤， 均未長期口服非甾體類消炎藥及糖皮質(zhì)激素;患者所有的臨床病理資料全面無缺失。所有患者中隨機選取18例， 取距腫瘤5 cm以上的癌旁胃組織作為對照組。所有患者術后接受至少4個周期的FOLFOX或XELOX方案化療， FISH檢測HER2陽性患者接受赫賽汀聯(lián)合化療。新鮮標本經(jīng)10%甲醛固定， 石蠟包埋， 厚4 ?m連續(xù)切片。

1. 2 試劑 兔抗人AEG-1抗體及兔抗人HER2抗體均購自英國Abcam公司。HER2基因檢測試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。AEG-1及GAPDH引物由上海生工生物工程公司合成， 兩步法RT-PCR試劑盒和PCR試劑購自普洛麥格公司。

1. 3 方法

1. 3. 1 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色sp方法檢測胃癌組及對照組中AEG-1、HER2的表達， 依照試劑盒的說明書實施染色。采用已知的AEG-1及HER2染色陽性的胃癌組織作為陽性對照， 以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作為陰性對照。由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法對切片進行觀察， 每張切片隨機選取5個（×400倍）高倍視野， 每個視野計數(shù)100個細胞。AEG-1染色陽性為細胞質(zhì)呈棕黃色著染， 評分結果為染色指數(shù)（陽性細胞比例×染色強度）， 其中染色指數(shù)得分為0～2為陰性表達， 3～9為陽性表達[6]。參照中國《胃癌HER2檢測指南》[8]進行HER2結果判斷：HER2以細胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達， 隨機選取5個視野（×200倍）， 每個視野計數(shù)100個細胞， 其中（-）為細胞膜均無著色或≤10%細胞的細胞膜呈淡黃色;（+）為>10%細胞的細胞膜呈淡黃色或有隱約可見的膜染色， 并且染色間斷， 未包繞細胞膜;（2+）為>10% 細胞的細胞膜呈黃色或棕黃色， 且染色連續(xù)， 包繞細胞膜;（3+）為>10% 細胞的細胞膜呈深棕色， 并且染色連續(xù)， 包繞細胞膜。

1. 3. 2 FISH法檢測HER2基因擴增 詳細操作步驟及判讀標準見說明書， 由病理醫(yī)師選定的檢測區(qū)域在蠟塊上做標記， 石蠟切片， 65℃下烤片1 h;采用二甲苯室溫脫蠟， 應用逐級酒精水化， 超純水浸泡3 min， 采用沸水煮片20 min;蛋白酶K反應液覆蓋組織， 37℃下消化5 min， 通過 2×SSC 緩沖液， 逐級酒精脫水;應用探針雜交液覆蓋組織， 蓋上蓋玻片， 采用橡皮膠水封邊， 85℃下變性5 min， 37℃下避光雜交過夜;孵育后， 通過2×SSC 緩沖液， 通過0.1% NP-40/2×SSC緩沖液， 采用70%乙醇脫水3 min， 滴加DAPI染液， 加蓋蓋玻片， 應用熒光顯微鏡觀察計數(shù)， 結果判讀采用參考文獻方法[9]。

1. 3. 3 RT-PCR檢測AEG-1 mRNA表達 石蠟切片樣品含有足夠比例的腫瘤細胞， 采用Trizol法提取組織總RNA， 隨后紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度， 取A260/A280比值為1.9～2.2的樣品1 ?g， 按兩步法RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄為cDNA， -20℃保存?zhèn)溆?。參照試劑盒說明書配制聚合酶鏈式反應（PCR）體系， 得到產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳， 應用GAPDH做內(nèi)參， 采用Image Lab 4.0分析PCR結果， AEG-1的mRNA表達相對值=AEG-1基因灰度值（T）/GAPDH灰度值（N）。PCR引物情況如下， AEG-1：上游引物5-GGC AAT TGG GTA GAC GAA GA-3， 下游引物5-CCTGTT TTG GAC GGG TTT TA-3;GAPDH：上游引物5-TCT TCG CTT TGT CCT TTC GT-3， 下游引物5-TGC TGT AGC CAA ATT CGT TG-3。PCR反應條件如下：94℃變性1 min， 55℃退火30 s， 72℃延伸1 min， 30個循環(huán)后72℃延伸2 min。AEG-1 mRNA在胃癌組織的條帶灰度值高于癌旁胃組織時為表達陽性。

治療后進行隨訪， 采用上門或電話問答等進行（包括患者飲食、睡眠等一般狀況和復發(fā)、轉移的情況）， 直至患者死亡， 若末次隨訪仍然存活則定為截尾值。隨訪截止時間2020年1月， 其中47例胃癌患者中無死亡病例。

1. 4 觀察指標 比較胃癌組織及癌旁胃組織中

AEG-1、HER2、AEG-1 mRNA表達情況;分析胃癌組織中HER2基因擴增情況;胃癌組織中AEG-1、HER2的表達與臨床病理特征的關系;分析在胃癌組織中AEG-1 mRNA表達與HER2基因擴增表達， AEG-1表達與HER2表達的相關性。

1. 5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗;相關性檢驗采用Spearman等級相關分析法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 胃癌組織及癌旁胃組織中AEG-1及HER2表達情況比較 AEG-1在胃癌組織中的陽性表達率為74.47%（35/47）， 明顯高于癌旁胃組織的0;HER2在胃癌組織中的陽性表達率為38.30%（18/47）， 明顯高于癌旁胃組織的0， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 胃癌組織中HER2基因擴增情況 采用FISH技術檢測到胃癌組織中HER2基因擴增9例， HER2基因擴增率為19.15% （9/47）， 免疫組化結果情況如下：HER2（3+）6例， 基因擴增6例;HER2（2+）7例， 基因擴增3例;HER2（+）5例， 基因擴增0例;HER2（-）29例， 基因擴增0例。

2. 3 RT-PCR檢測胃癌組織和癌旁胃組織AEG-1 mRNA表達情況比較 應用RT-PCR檢測胃癌組織和癌旁胃組織中AEG-1 mRNA表達結果提示， 胃癌組織中AEG-1 mRNA陽性表達35例。胃癌組織中AEG-1 mRNA表達水平（0.702±0.123）顯著高于癌旁胃組織的（0.244±0.111）， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2. 4 胃癌組織中AEG-1 mRNA表達、HER2基因擴增與臨床病理特征的關系分析 胃癌組織中不同分化程度、TNM分期及淋巴結轉移患者的AEG-1 mRNA表達陽性情況比較， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 分化程度越低、TNM分期越晚、有淋巴結轉移， 其陽性表達越高， 但AEG-1 mRNA表達與胃癌的年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度無關， 差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。胃癌組織中不同分化程度患者的HER2基因擴增情況比較， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 分化程度越高， 其基因擴增率越高， 但HER2基因擴增與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移無關， 差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

2. 5 胃癌組織中AEG-1 mRNA及HER2基因擴增表達的相關性分析 胃癌組織中AEG-1 mRNA表達與HER2基因擴增無相關性（P>0.05）。見表4。

2. 6 胃癌組織中免疫組化AEG-1表達與HER2表達的相關性分析 胃癌組織中免疫組化AEG-1表達與HER2陽性表達呈正相關（r=0.361， P=0.033<0.05）。見表5。

3 討論

采用免疫組織化學方法、RT-PCR及FISH檢測AEG-1、HER2在胃癌組織中表達， 研究其與胃癌臨床病理特征的關系， 并探討AEG-1與HER2在胃癌組織中表達的相關性。

首先Su等[10]于2002年克隆出來AEG-1基因， 后來Kang等[11]測定AEG-1基因共包含12個外顯子和11個內(nèi)含子， 編碼由582個氨基酸組成的單次跨膜蛋白。眾多研究表明AEG-1可以在腫瘤的多個方面發(fā)揮關鍵作用， 并且AEG-1在多種惡性腫瘤中高表達， 還與這些腫瘤的進展以及臨床不良預后相

關[12]。曾有研究提示AEG-1在胃癌組織中高表達， 其表達與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移有關[6]。但伊朗的研究提示， 胃癌腫瘤組AEG-1基因的表達僅比配對的非腫瘤組表達稍高， 并且其表達與腫瘤分期、分級無關[7]。本研究顯示胃癌組織中不論是采用免疫組化還是RT-PCR檢測AEG-1表達， 其陽性表達率均明顯高于癌旁胃組織， 而且其陽性表達與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。本研究結果與既往Xu等[5]研究結果類似， 因此認為AEG-1可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展， 對胃癌的轉移有推動作用。將來還有待于大樣本、多中心研究及細胞水平研究， 來進一步證實胃癌中AEG-1的重要作用。

HER2屬于原癌基因， 是HER2/erbB家族成員， 其定位在染色體17q12， 編碼產(chǎn)物為Ⅰ型跨膜生長因子受體酪氨酸激酶[13]。HER2在乳腺癌、胃癌細胞中可以異常擴增和（或）過表達， 可以導致腫瘤細胞內(nèi)信號通路的異?；罨?， 并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉移有關[14]。本研究表明HER2在胃癌組織中的陽性表達率為38.30%（18/47）， 明顯高于癌旁胃組織的0， 并且HER2基因擴增與分化程度有關， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但其與浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移無關。這與既往研究結果[15]類似， 但又有不同， 可能與研究樣本量、病例臨床分期不同等有關， 本研究顯示HER2參與了胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉移過程。

既往研究表明， AEG-1/MTDH在乳腺癌細胞中通過上調(diào)Her2/neu表達促進癌癥增殖和侵襲[16]。本研究顯示胃癌組織中AEG-1 mRNA表達與HER2基因擴增無相關性（P>0.05）。胃癌組織中免疫組化AEG-1表達與HER2表達呈正相關（r=0.361， P=0.033<0.05）?？赡芘c研究樣本量、臨床分期等因素有關， 推測胃癌組織中AEG-1可能通過上調(diào)HER2信號通路改變胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移， 但還需要胃癌細胞水平研究進一步揭示具體機制。

綜上所述， 胃癌組織中AEG-1、HER2表達明顯高于癌旁胃組織， 并且與胃癌的臨床病理特征相關。胃癌組織中可能存在AEG-1、HER2信號通路。檢測胃癌組織中AEG-1、HER2的表達， 有助于判斷胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉移。

參考文獻

[1] 季加孚. 我國胃癌防治研究三十年回顧. 中國腫瘤臨床， 2013， 40（22）：1345-1351.

[2] Emdad L， Sarkar D， Su ZZ， et al. Astrocyte elevated gene-1： recent insights into a novel gene involved in tumor progression， metastasis and neurodegeneration. Pharmacol Ther， 2007， 114（2）：155-170.

[3] 唐煥， 尹曉玲， 張獻全. HER2與胃癌預后的研究進展. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2018， 34（10）：1522-1525.

[4] Bang YJ， Van Cutsem E， Feyereislova A， et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2 -positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer （To-GA）： a phase 3， open-label， randomised controlled trial. Lancet， 2010， 376（9742）：687-697.

[5] Xu JB， Wu H， He YL， et al. Astrocyte-elevated gene-1 overexpression is associated with poor prognosis in gastric cancer. Med Oncol， 2011， 28（2）：455-462.

[6] 劉凱軍， 李勇， 王文韜. 胃癌組織中AEG-1的表達及與臨床病理特征的關系研究. 河北醫(yī)藥， 2012， 34（5）：653-655.

[7] Baygi ME， Nikpour P. Deregulation of MTDH gene expression in gastric cancer. Asian Pac J Cancer Prev， 2012， 13（6）：2833-2836.

[8] 《胃癌HER2檢測指南（2016版）》專家組. 胃癌HER2檢測指南（2016版）. 中華病理學雜志， 2016， 45（8）：528-532.

[9] Tafe LJ， Steinmetz HB， Allen SF， et al. Rapid fluorescence in situ hybridisation （FISH） for HER2 （ERBB2） assessment in breast and gastro-oesophageal cancer. J Clin Pathol， 2015， 68（4）：306-308.

[10] Su ZZ， Kang DC， Chen Y， et al. Identification and cloning of human astrocyte genes displaying elevated expression after infection with HIV-1 or exposure to HIV-1 envelope glycoprotein by rapid subtraction hybridization， RaSH. Oncogene， 2002， 21（22）：3592-3602.

[11] Kang DC， Su ZZ， Sarkar D， et al. Cloning and characterization of HIV-1-inducible astrocyte elevated gene-1， AEG-1. Gene， 2005， 353（1）：8-15.

[12] Huang Y， Li LP. Progress of cancer research on astrocyte elevated gene-1/Metadherin （Review）. Oncol Lett， 2014， 8（2）：493-501.

[13] 中國臨床腫瘤學會抗腫瘤藥物安全管理專家委員會， 中國抗癌協(xié)會胃癌專業(yè)委員會， 中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會. HER2陽性晚期胃癌分子靶向治療的中國專家共識（2016版）. 臨床腫瘤學雜志， 2016， 21（9）：831-839.

[14] Korkaya H， Paulson A， Iovino F， et al. HER2 regulates themammary stem/progenitor cell population driving tumorigenesisand invasion. Oncogene， 2008， 27（47）：6120-6130.

[15] 阿娜爾古麗·阿布都熱合曼， 迪麗努爾·阿西木. 胃癌組織中Akt2、HER2蛋白表達與臨床病理學特征的關系. 實用癌癥雜志， 2015， 30（12）：1767-1770.

[16] Zhang X， Zhang N， Zhang MX. Astrocyte elevated gene-1 induces breast cancer proliferation and invasion through upregulating HER2/neu expression. Chin Med J （Engl） 2011， 124（21）：3546-3550.

[收稿日期：2020-02-19]