李姝　郝艷坤　李爽　邢春旭

【摘要】目的 研究淫羊藿苷逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞惡性表型結(jié)果。方法 使用淫羊藿苷粉劑、培養(yǎng)基、小牛血清、PKA試劑盒進(jìn)行菌株培養(yǎng)試驗(yàn)，檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)侵襲力和PKA活性的影響。結(jié)果 濃度高的淫羊藿苷對(duì)于胃癌細(xì)胞的惡性表型影響更顯著，結(jié)果顯示，高濃度淫羊藿苷對(duì)胃癌細(xì)胞黏附性影響隨著時(shí)間延長而逐漸增強(qiáng)，最高可達(dá)到（18.9±0.4），對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移速度影響逐漸下降，最低為（1.27±0.22）μm/h，對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲力影響結(jié)果顯示，高濃度組穿模數(shù)為（45.23±0.56）個(gè)，各項(xiàng)結(jié)果都與對(duì)照組有明顯差異（P<0.05）。結(jié)論 淫羊藿苷可以對(duì)胃癌細(xì)胞的黏性、遷移速度和侵襲力進(jìn)行控制，有利于逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的惡性表型。

【關(guān)鍵詞】胃癌細(xì)胞;淫羊藿苷;侵襲力

【中圖分類號(hào)】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095.6681.2020.20..02

中藥淫羊藿苷主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞黏附與運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生抗腫瘤轉(zhuǎn)移功效的一種藥物[1]。臨床上發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷對(duì)胃癌細(xì)胞株細(xì)胞的黏附性與運(yùn)動(dòng)性信號(hào)分子蛋白激酶A會(huì)產(chǎn)生一定的影響，本文就此展開淫羊藿苷逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞惡性標(biāo)案的作用與機(jī)制研究，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇上海友思生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的淫羊藿苷粉劑，Hyclone公司研發(fā)的培養(yǎng)基，Gibco公司生產(chǎn)的小牛血清與Promega公司生產(chǎn)的PKA試劑盒。

1.2 方法

將細(xì)胞株放置到10%小牛血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有100 mg/L的青霉素與鏈霉素，將培養(yǎng)菌株放置到37攝氏度，濃度為5%的二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

用0.25%的胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞，滅菌PBS稀釋離心去上清后培養(yǎng)基重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)。將胃癌細(xì)胞濃度調(diào)整為106/ml后按照每孔90 μL的種板規(guī)格培養(yǎng)24 h，并分為對(duì)照組、低濃度組（100 mg/L）、中濃度組（200 mg/L）和高濃度組（400 mg/L），加入濃度不同的淫羊藿苷培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每孔設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別在12 h、24 h、36 h和48 h收獲。使用離心機(jī)設(shè)備分離上清，并以0.25%的胰酶消化，每孔加入90 μL的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入MTT20 μL，設(shè)置隱形對(duì)照。在37設(shè)施度的環(huán)境下連續(xù)孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L的DMSO，共計(jì)100 μL。吸管反復(fù)吹打成接近結(jié)晶顆粒，溶解后使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行密度值測(cè)量，波長設(shè)定為490 nm。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）侵襲力測(cè)定：使用Matrigel膠重建基底膜，并以體外研究的方式，測(cè)定腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移行為，以更加簡(jiǎn)單和快速的方式，獲取侵襲力結(jié)果。加入Transwell小室表面，并在室溫下進(jìn)行通風(fēng)干燥過夜。應(yīng)用前Matrigel無血清培養(yǎng)基重新構(gòu)建20分鐘之后備用，調(diào)整細(xì)胞的濃度，并加入600 μL、濃度為20%的小牛血清，在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。使用甲醛固定30分鐘之后，蘇木素染色2至5分鐘，并去除insert上方細(xì)胞。在顯微鏡下計(jì)算膜下面的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，根據(jù)清晰細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量，判斷腫瘤細(xì)胞實(shí)際侵襲能力。

（2）PKA活性測(cè)定：使用Promega公司生產(chǎn)的PT非放射性PKA活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢驗(yàn)。分別取各組胃癌細(xì)胞5×106至1×107個(gè)，在冰上加入0.5 ml的PKA抽取液，同樣采用反復(fù)吹打的方式，15分鐘后收集提取液，進(jìn)行5分鐘的冷凍離心操作，收集上清液。使用考馬斯亮藍(lán)試劑盒定量總蛋白，按照試劑盒說明的檢測(cè)方法對(duì)齊活性進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料（x±s）表示，t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以（%）表示，x2檢驗(yàn)。P<0.05即為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 淫羊藿苷對(duì)胃癌細(xì)胞的黏附性影響

經(jīng)過淫羊藿苷處12小時(shí)之后，胃癌細(xì)胞在I型膠原上的黏附40分鐘開始，黏附率明顯降低，并且這種黏附抑制作用會(huì)隨著時(shí)間的延長而不斷延長。見表1。

2.2 淫羊藿苷對(duì)胃癌細(xì)胞遷移影響

對(duì)照組的遷移速度為（2.28±0.31）μm/h，低濃度組為（2.01±0.24）μm/h、中濃度組為（1.96±0.21）μm/h，高濃度組（1.27±0.22）μm/h。各組與對(duì)照組相比，差異結(jié)果顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 淫羊藿苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲力的影響

對(duì)照組穿模細(xì)胞數(shù)為（137.32±0.32）個(gè)，低濃度組為（102.03±0.64）個(gè)、中濃度組為（68.35±0.55）個(gè)，高濃度組（45.23±0.56）個(gè)。各組與對(duì)照組相比，差異結(jié)果顯著，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討 論

綜上所述，胃癌屬于消化道惡性腫瘤疾病，受到其浸潤性和轉(zhuǎn)移性因素的影響，臨床治療工作效果并不理想。通過研究發(fā)現(xiàn)，胃癌腫瘤細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)能力和侵襲性是其出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和浸潤的主要原因。本文研究得出，淫羊藿苷對(duì)于胃癌腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移有抑制作用，且這種效果與淫羊藿苷細(xì)胞活性有關(guān)。胃癌發(fā)病隱秘、發(fā)展迅速并且死亡率很高，很多時(shí)候臨床上確診時(shí)就已經(jīng)屬于中晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)，只能依靠放化療縮小腫瘤，副作用較大[2]。近幾年，多西紫杉醇、替吉奧、卡培他賓等藥物對(duì)于全身性抗癌治療有較好的效果[3]?，F(xiàn)代腫瘤治療已經(jīng)突破了傳統(tǒng)治療手段存在的殺傷指數(shù)小、抗癌能力低和不良反應(yīng)明顯等問題，淫羊藿苷作為新型綠色抗癌藥物，根據(jù)不同腫瘤分期和患者的實(shí)際情況，在治療期間可以發(fā)揮出扶正培本、活血化瘀等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)中西醫(yī)結(jié)合特色治療方法和有針對(duì)性的個(gè)體化治療，對(duì)于腫瘤治療有較好的效果[4-5]。

參考文獻(xiàn)

[1] 楊軼舜，吳華燕，宋澤家.3種淫羊藿苷次生產(chǎn)物的制備及HPLC測(cè)定[J].中成藥，2020，42（03）：779-782.

[2] 章曉云，張 馳，宋世雷.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和蛋白模塊分析淫羊藿治療骨關(guān)節(jié)炎的作用與機(jī)制[J].中國組織工程研究，2020，24（17）：2660-2666.

[3] 陳素華，馬天江，張智慧.淫羊藿苷通過下調(diào)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2抑制MGC803細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，39（11）：1587-1591.

[4] 鞠 靜.淫羊藿苷和寶藿苷I對(duì)氣管切開大鼠早期肺部炎癥及免疫指標(biāo)的影響[D].廣西醫(yī)科大學(xué)，2019.

[5] 劉小菊，張美芝，陳 丹.淫羊藿苷防治惡性腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].河北中醫(yī)，2018，40（11）：1748-1752.