楊孝斌，寧雪靜 ，吳繼春 ，何席呈 ，杜 江▲

(1貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550000；2貴州省苗醫(yī)藥重點實驗室，貴州 貴陽 550000)

三匹風又名蛇莓(Duchesneaindica(Andr.) Focke)，為薔薇科蛇莓屬的多年生草本植物[1]。生于山坡、道邊及雜草間，在遼寧以南的全國各省區(qū)均有分布[2]，民間主要用于治療痢疾、腸炎、水火燙傷、蛇咬傷、疔瘡腫毒[3]。現(xiàn)代研究表明該屬植物含有豐富的黃酮、三萜、酚酸及酚酸脂、其他類等化學成分[4]及顯著的抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗單純皰疹病毒[7]等藥理活性。課題組前期在苗族地區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)鮮藥三匹風在苗族民間治療蛇尿瘡有顯著的效果，為了深入研究該屬植物的抗單純皰疹病毒的活性成分，課題組對三匹風化學成分進行了分離研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bruker AVANCE NEO-400Mhz (德國布魯克公司)；ZF-7A型紫外光譜儀 (上海勤科分析儀器有限公司)；W-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-DIII型多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；SK8200LHC超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

層析硅膠：(200～300目、300～400目)青島海洋化工有限公司；硅膠薄層層析板：(GF254)青島海洋化工有限公司；聚酰胺：(100～200目)國藥集團化學試劑有限公司；聚酰胺薄膜：(薄層層析板)國藥集團化學試劑有限公司；顯色劑：10%硫酸乙醇試劑；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗藥材2019年5月采于貴州省貴陽市，由貴州中醫(yī)藥大學劉曉龍老師鑒定為蛇莓(Duchesneaindica(Andr.) Focke)。

2 提取分離

自然干燥的蛇莓藥材(5 kg)粉碎后用75%甲醇滲漉提取一周，提取液減壓回收溶劑，濃縮后得總提物500 g。總提取物分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分為三部分，石油醚部分55.4 g、乙酸乙酯部分109.4 g、正丁醇部分211.5 g。石油醚部分進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(10∶1-5∶1-2∶1)梯度洗脫，薄層層析檢測，分為SA和SB兩部分，SB部分通過反復硅膠柱層析(石油醚-乙酸乙酯5∶1)得化合物1 (67 mg)和化合物2 (71 mg)。乙酸乙酯部分進行聚酰胺柱層析，乙醇(30%、50%、70%)梯度洗脫，聚酰胺薄層檢測，分為YA、YB、YC三部分，YA部分經(jīng)過聚酰胺層析，乙酸乙酯-乙醇-冰醋酸-水(30∶5∶1∶1)等梯度洗脫，聚酰胺薄層檢測，分為YA1、YA2、YA3三個部分。YA1部分反復硅膠柱層析(二氯甲烷醇8∶1)得到化合物3 (13 mg)、4 (20 mg)。YB部分通過反復硅膠柱層析(二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-8∶3∶1，石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-5∶1∶1∶1)得到化合物5 ( 10 mg)、6 (21 mg)、7 (17 mg)。

3 結(jié)構鑒定(圖1)

化合物1透明油狀物。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d)δ5.58-5.11 (m，6H-9，10，12，13，15，16)，2.79 (dd，J=8.1，7.1 Hz，H-11，14)，2.33 (t，J=7.5 Hz，2H，H-2)，1.68-1.58 (m，2H，H-3)，1.34-1.24 (m，8H，H-4，5，6，7)，0.95-0.85 (m，3H，H-18)。13C-NMR (100MHz，Chloroform-d)δ130.73(C-16)，129.02(C-9)，127.09(C-12)，127.05(C-13)，126.60(C-15)，125.96(C-10)，32.97(C-2)，28.41(C-5)，28.00(C-6)，27.92(C-7)，27.88(C-8)，26.03(C-14)，24.46(C-11)，24.37(C-3)，23.50(C-17)，19.39(C-4)，13.09(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物1為linolenic acid。

圖1 蛇莓中分離到的化合物結(jié)構圖Fig.1 Structures of the compounds isolated from Duchesnea indica

化合物2透明油狀物。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d)δ5.39 (tq，J=6.9，1.4 Hz，H，H-2)，4.14 (d，J=6.9 Hz，2H，H-1)，2.01-1.95 (m，2H，H-4)，1.65 (s，3H，H-20)，1.61-1.17 (m，19H)，0.88-0.82 (m，12H，brs)。13C-NMR (100 MHz，Chloroform-d)δ140.20(C-3)，123.09(C-2)，59.35(C-1)，39.88(C-4)，39.38(C-14)，37.44(C-8)，37.37(C-10)，37.29(C-12)，36.68(C-6)，32.79(C-7)，32.70(C-11)，27.98(C-15)，25.15(C-5)，24.80(C-13)，24.48(C-9)，22.72(C-17)，22.63(C-16)，19.75(C-18)，19.72(C-19)，16.16(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為trans-phytol。

化合物3白色針晶。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d)δ5.88 (s，H，H-4)，5.78 (s，H，H-8)，4.38 (p，J=6.8，6.1 Hz，H，H-9)，2.43 (dd，J=17.0，3.7 Hz，H，H-2a)，2.21 (d，J=17.0 Hz，H，H-2b)，1.88 (s，3H，H-11)，1.30-1.23 (m，3H，H-10)，1.06 (s，3H，H-12)。13C-NMR (100 MHz，Chloroform-d)δ198.41(C-1)，163.39(C-3)，135.69(C-2’)，129.03(C-1’)，126.78(C-2)，79.03(C-4)，68.02(C-3’)，49.68(C-6)，41.20(C-5)，24.04(C-4’)，23.70(C-5，Meβ)，22.9(C-5，Meɑ)2，19.04(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為Vomifoliol。

化合物4無色晶體。11H-NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ3.60 (d，J=5.7 Hz，H，H-6)，3.53 (d，J=4.0 Hz，H，H-3)，2.93 (t，J=2.9 Hz，H，H-8)，1.87 (p，J=1.9 Hz，H，H-5eq)，1.51 (dd，J=7.0，2.8 Hz，H，H-2eq)，0.93 (t，J=3.5 Hz，H，H-1)，0.89 (q，J=2.8，2.2 Hz，H，H-4)，0.83 - 0.80 (m，H，H-2ax)，0.74 (dt，J=5.9，2.8 Hz，H，H-5ax)，0.67 (d，J=1.3 Hz，H，H-7)，0.40 (d，J=2.4 Hz，H，H-9)，0.36 (d，J=2.5 Hz，H，H-10)。13C-NMR (100 MHz，DMSO-d6)δ69.84(C-3)，67.86(C-6)，42.11(C-1)，38.23(C-2)，35.03(C-4)，30.86(C-5)，24.77(C-8)，20.96(C-7)，18.43(C-9)，16.08(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為(+)-(6s)-Hydroxymenthol。

化合物5白色粉末。1H-NMR (400 MHz，Methanol-d4)δ5.31-5.29 (m，1H，H-12)，3.94 (ddd，J=12.0，4.4，2.8 Hz，H，H-2β)，3.33 (d，J=2.8 Hz，H，H-3β)，1.36 (s，3H，H-27)，1.29 (s，3H，H-29)，1.20 (s，3H，H-23)，0.94 (d，J=6.7 Hz，3H，H-26)，0.88 (s，3H，H-30)，0.79 (s，3H，H-25)。13C-NMR(100 MHz，Methanol-d4)δ180.93(C-28)，138.67(C-13)，127.96(C-12)，78.71(C-3)，72.19(C-19)，65.89(C-2)，53.68(C-18)，48.03(C-5)，47.18(C-9)，46.80(C-17)，41.69(C-14)，41.33(C-1)，41.08(C-20)，39.85(C-8)，38.07(C-4)，37.97(C-10)，37.62(C-22)，32.70(C-7)，29.43(C-23)，28.24(C-15)，25.81(C-29)，25.58(C-21)，25.20(C-16)，23.53(C-27)，23.31(C-11)，21.05(C-24)，17.88(C-6)，16.14(C-26)，15.49(C-30)，15.22(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為euscaphic acid。

化合物6白色粉末。1H-NMR (400 MHz，Methanol-d4)δ5.26 (t，J=3.7 Hz，1H，H-12)，3.50 (dd，J=9.9，5.9 Hz，1H，H-3a)，2.85 (s，1H，H-18)，1.53 (S，3H，Me-29)，1.30(S，3H，Me-24)，1.28-1.22(m，6H，Me-26，Me-30)，1.10(S，6H，Me-23，Me-25)。13C-NMR (100 MHz，Methanol-d4)δ181.11(C-28)，138.37(C-13)，128.82(C-12)，78.76(C-3)，72.94(C-19)，55.34(C-5)，53.50(C-18)，49.43(C-9)，47.71(C-17)，41.43(C-14)，41.30(C-20)，39.91(C-8)，38.74(C-1)，38.63(C-4)，37.70(C-22)，36.98(C-10)，32.93(C-7)，28.33(C-23)，27.92(C-15)，26.71(C-2)，26.08(C-21)，25.52(C-16)，24.18(C-27)，23.66(C-11)，18.49(C-6)，16.50(C-26)，15.90(C-30)，15.49(C-25)，15.12(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物6為pomolic acid。

化合物7白色片狀晶體。1H-NMR (400 MHz，Chloroform-d)δ5.34 (t，J=3.7 Hz，H，H-12)，4.50 (d，J=1.6 Hz，H，H-3)，2.54-2.52 (m，H，H-18)，2.05 (s，3H，CH3CO)，1.21 (s，3H，H-27)。13C-NMR (100 MHz，Chloroform-d)δ184.03(C-28)，171.10(C-OCOCH3)，137.92(C-13)，129.26(C-12)，80.98(C-3)，73.09(C-19)， 55.18(C-5)，52.80(C-18)，47.73(C-17)，47.09(C-9)，41.07(C-14)，41.03(C-20)，39.95(C-8)，38.05(C-1)，37.67(C-4)，37.54(C-22)，36.92(C-10)，32.57(C-7)，28.18(C-15)，28.03(C-23)，27.42(C-29)，25.97(C-21)，25.32(C-16)，24.48(C-27)，23.65(C-2)，23.51(C-11)，21.31(C-OCOCH3)，18.38(C-6)，17.00(C-26)，16.67(C-24)，16.16(C-25)，15.32(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的NMR數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物7為19α-hydroxy-3-acetyl ursolic acid。

4 討論

三匹風貴州省資源豐富，苗族民間使用廣泛，具有較好的開發(fā)前景，化學成分較多，目前已經(jīng)分到一百多個化合物。苗族民間用來治療蛇尿瘡有顯著療效，本實驗對苗藥三匹風進行快速分離，分離出含量較多的單體化合物，并進行抗單純皰疹病毒活性篩選。目前分離鑒定出五個萜類、一個脂肪酸、一個脂肪醇，分別是linolenic acid(1)、trans-phytol(2)、Vomifoliol(3)、(+)-(6s)-Hydroxymenthol(4)、euscaphic acid(5)、pomolic acid(6)、19α-hydroxy-3-acetyl ursolic acid(7)，化學結(jié)構見圖1。其中化合物3有良好的腫瘤增殖抑制作用[9]，化合物5具有一定的促凝血活性[15]、較弱的抗炎活性[16]，坡模酸具有很弱的抗炎活性[16]，植醇是合成維生素E、維生素K1的原料[17]。

苗族人民在長期的發(fā)展中形成自己獨特的診療體系，深入挖掘民間廣泛使用的苗藥有利于實現(xiàn)民族產(chǎn)業(yè)化，增加社會效益，符合我國大力發(fā)展中藥民族藥的政策，但是藥效物質(zhì)基礎不明制約了苗藥三匹風向深層次的發(fā)展。有文獻報道蛇莓乙醇總提取物體外抗單純皰疹病毒效果最好[7]，更具有研究價值，通過本課題研究，期望得到抗單純皰疹病毒效果好的單體化合物，為該植物的進一步開發(fā)、為本地區(qū)的民族藥產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。