張 敏，黃穎雪，李 瑋，鄭繼廣，何蘭蘭，王 令，王小波

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

隨著社會(huì)的發(fā)展，由于飲食節(jié)律、工作壓力、情志等原因，具有消化道疾病的人群越來越多，尤其以胃潰瘍疾病等最為常見。目前，在臨床上大多采用西藥聯(lián)合療法治療消化道疾病，如奧美拉唑、阿莫西林聯(lián)合克拉霉素三聯(lián)療法治療幽門螺桿菌胃潰瘍[1]，黛力新聯(lián)合三聯(lián)療法治療伴有焦慮抑郁癥消化性潰瘍等[2]，其治療作用較顯著，但其對(duì)人體的毒副作用較大。

苗藥加格略為百合科植物七葉一枝花ParispolyphyllaSmith的根莖，加格略又名重樓、七葉一枝花、燈臺(tái)七、獨(dú)角蓮，具有清熱解毒、消腫止痛的功效，主要用于乳腺炎、胃潰瘍、胃出血、子宮頸糜爛等癥[3]?，F(xiàn)代研究表明，加格略具有抗胃潰瘍、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤等藥理作用[6-11]。苗醫(yī)藥在治療胃潰瘍、胃出血癥時(shí)采用蒸制品。因此，本研究以胃粘膜損傷、IL-2、IL-6及TNF-α為檢測(cè)指標(biāo)，比較蒸制前后加格略抗胃潰瘍的差異，挖掘出民族藥藥用價(jià)值，對(duì)加格略抗胃潰瘍機(jī)制及尋找和開發(fā)療效確切、毒副作用小的胃潰瘍藥物研究具有一定的意義。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，SPF級(jí)108只，雌雄各半，體重18～20 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2014—0011。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

實(shí)驗(yàn)藥材購自安順市寶林科技中藥飲片有限公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定為七葉一枝花ParispolyphyllaSmith的新鮮根莖。

鹽酸雷尼替丁膠囊(批號(hào)：07019030443，廠家：石藥控股集團(tuán)河北永豐藥業(yè)有限公司)，購自花溪永康大藥房；IL-2 ELisa試劑盒(貨號(hào)GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)；IL-6ELisa試劑盒(貨號(hào)GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)，TNF-αELisa試劑盒(貨號(hào)GR-201907-01，武漢基因美科技有限公司)，均購自貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。組織標(biāo)本固定液(10%中性甲醛固定液)：多聚甲醛(批號(hào)：20180112，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，蘇木素染液(貨號(hào)：G1005-1，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，伊紅染液(貨號(hào)G1001，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇(分析純，批號(hào)：2018年05月30日，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀集團(tuán)公司)，Bio-tek-ELx800酶標(biāo)儀(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液的制備

分別取加格略蒸品和生品極細(xì)粉，添加0.5%羧甲基纖維素鈉適量溶解，制成濃度分別為0.348 g/mL、0.174 g/mL、0.087 g/mL的藥液。取鹽酸雷尼替丁，加0.5%羧甲基纖維素鈉適量溶解，制成濃度為0.003 g/mL的藥液。

2.2 動(dòng)物分組、給藥及模型的建立

SPF小鼠108只，于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。將其隨機(jī)分為9組，每組12只，雌雄各半，分別為正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)藥物組、陽性藥物組。實(shí)驗(yàn)藥物組分別以0.2 mL/10g灌胃加格略生品和蒸品藥粉高、中、低劑量組，正常組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉，陽性組灌胃等量鹽酸雷尼替丁膠囊藥液，連續(xù)給藥7天，每天1次。第7天給藥1 h后，除正常組外，均以1 mL/100g灌胃無水乙醇建立胃潰瘍模型。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

造模1 h后，對(duì)小鼠進(jìn)行摘眼球取血，血清以4000 r/min 離心(離心半徑為7 cm)10 min，取上清液即為血清，按照ELisa試劑盒說明書測(cè)定IL-2、IL-6及TNF-α的濃度。小鼠脫頸處死，解剖小鼠，取各主要臟器進(jìn)行稱重。切下全胃，擠出胃內(nèi)容物離心。將胃先注入冰生理鹽水將胃清洗干凈，沿胃大彎剪開胃組織，用肉眼和放大鏡觀察胃粘膜出血、潰瘍大小等狀況，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍長、寬，計(jì)算胃潰瘍抑制率[胃潰瘍抑制百分率(%)=(模型組胃潰瘍指數(shù)-給藥組胃潰瘍指數(shù))/模型組胃潰瘍指數(shù)×100%，胃潰瘍指數(shù)(潰瘍面積)=潰瘍長×潰瘍寬。再將胃浸入4%的多聚甲醛組織固定液中固定48 h，固定完成后，根據(jù)HE染色方法對(duì)胃組織進(jìn)行切片染色顯微鏡觀察。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用spss statistics 23.0統(tǒng)計(jì)計(jì)算軟件，以單因素方差分析比較各檢測(cè)指標(biāo)是否具有顯著性差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)潰瘍面積的影響

肉眼及顯微鏡觀察胃的組織情況，發(fā)現(xiàn)模型組具有明顯的點(diǎn)狀、線性及潰瘍面，空白組無明顯潰瘍，說明胃潰瘍模型建立成功。藥物組與模型組相比較，藥物組的潰瘍點(diǎn)數(shù)及面積明顯減少。

3.2 對(duì)胃黏膜病理學(xué)形態(tài)的影響

空白組胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列整齊，腺體底部多見主細(xì)胞，呈錐狀或柱狀，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見血管和神經(jīng)，未見明顯增生。模型組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺萎縮，局部胃腺壞死；固有層間質(zhì)內(nèi)出血，見紅細(xì)胞溢出血管散在分布，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見炎細(xì)胞浸潤。陽性組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列整齊，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細(xì)胞浸潤。生品低劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，局部固有層內(nèi)少量胃腺壞死，黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見少量炎細(xì)胞浸潤。生品中劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細(xì)胞浸潤。生品高劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整，胃腺排列較為整齊，胃腺細(xì)胞未見明顯變性壞死；黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細(xì)胞浸潤。蒸品低劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整；黏膜層細(xì)胞排列較紊亂，部分胃腺細(xì)胞壞死，固有層及黏膜下層少量炎細(xì)胞散在浸潤。蒸品中劑量組，黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜層細(xì)胞排列較紊亂，固有層及黏膜下層少量炎細(xì)胞散在浸潤。蒸品高劑量組黏膜結(jié)構(gòu)完整；黏膜層細(xì)胞較紊亂，固有層及黏膜下層伴有少量炎細(xì)胞浸潤，黏膜下層、肌層及外膜未見明顯炎細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 小鼠胃組織病理切片(HE×100)Fig.1 Pathological sections of the stomachs of mice(HE×100)

3.3 對(duì)胃潰瘍抑制率的影響

生品高中低劑量組對(duì)小鼠潰瘍平均抑制率分別為52.86%、25.89%、15.18%，蒸品高中低劑量的平均抑制率分別為48.21%、16.96%、12.33%，陽性的平均抑制率為27.6%。通過各藥物組生品與蒸制品相比較，結(jié)果表明，生品藥物組對(duì)潰瘍的抑制率較蒸品組高，見表1。

3.4 對(duì)小鼠IL-2、IL-6及TNF-α的影響

(1)對(duì)IL-2的影響：與模型組比較，空白組濃度降低，差異具有顯著性意義(P<0.05)，生品高、中劑量和蒸制品高劑量組IL-2顯著降低，具有極顯著差異(P<0.01)；與陽性組比較，生品高劑量組IL-2濃度降低，具有顯著性差異(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果說明生品高劑量組對(duì)IL-2具有較好的抑制率。

(2)對(duì)IL-6的影響：與模型組相比較，藥物生品和蒸制品高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，且生品高劑量組IL-6的濃度小于蒸制品高劑量組，說明生品高劑量組較蒸品高劑量組對(duì)IL-6具有更好的抑制作用。

(3)對(duì)TNF-α的影響：與模型組比較，生品高、中劑量組，蒸品高劑量組均具有顯著性差異(P<0.05)，說明生品高、中劑量，蒸品高劑量對(duì)TNF-α均具有較好的抑制作用，且生品高劑量的效果更好；與陽性組相比較，生品高劑量組差異顯著(P<0.05)，說明生品高劑量對(duì)TNF-α的抑制作用較陽性藥物好。見表1。

表1 加格略藥材對(duì)乙醇致胃潰瘍各檢測(cè)因子的影響(n=12，x±s)Tab.1 Effects of Paris polyphylla on ethanol-induced gastric ulcer(n=12, x±s)

4 討論

胃潰瘍?yōu)榕R床常見的消化性疾病，其主要表現(xiàn)在胃粘膜組織的損傷、胃酸分泌增加、胃出血、炎性因子增加等。誘發(fā)胃潰瘍的原因主要有外部刺激、情志以及幽門螺旋桿菌感染等。

研究發(fā)現(xiàn)，陽性組，生品高、中、低劑量組，蒸品高、中、低劑量組等各藥物組動(dòng)物胃組織病變程度均有不同程度減輕；各用藥組中，蒸品高劑量組和低劑量組動(dòng)物胃組織病變相對(duì)較重，生品中、低劑量組和蒸品中劑量組病變程度相對(duì)較輕，生品高劑量組和陽性組基本正常。通過藥物組與空白組、模型組及陽性組之間IL-2、IL-6、TNF-α的比較，得出加格略生品與蒸制品對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍炎性因子具有一定的抑制作用。

通過加格略生品與蒸制品抗胃潰瘍對(duì)比研究表明，加格略對(duì)無水乙醇胃潰瘍的抑制作用主要通過抑制潰瘍面積，改善胃黏膜組織損傷，降低IL-2和TNF-a的濃度，減輕胃腺壞死、胃出血及炎細(xì)胞浸潤等達(dá)到抗胃潰瘍的效果，其中生品對(duì)無水乙醇胃潰瘍作用較蒸品強(qiáng)。本研究可為加格略抗胃潰瘍機(jī)制研究奠定一定的基礎(chǔ)。