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        苗藥課幣有水溶性黃酮的純化*

        2020-09-02 03:42:52趙學(xué)芬何席呈杜汪洋吳珊珊
        貴州科學(xué) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:黃酮

        趙學(xué)芬,何席呈,2,杜汪洋,譚 波,張 婷,吳珊珊,杜 江,2▲

        (1貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025;2貴州省苗醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025;3貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

        苗藥課幣有(kod bit vud)來(lái)源于天南星科植物一把傘南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott的塊莖[1]。多生于海拔3200米以下的林下、灌叢及陰濕的溝谷里;其植物除西北、西藏外,大部分省都有分布[2]。苗醫(yī)認(rèn)為課幣有(kod bit vud)味麻、辣,性熱;有毒,入冷經(jīng),走中、里兩關(guān),入腦、身兩架;具有敗毒,清風(fēng)毒,止痙,化痰散結(jié)的功能[3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),Arisaemaerubescens(Wall.) Schott(A.erubescens)的化學(xué)成分有:黃酮類[4]、脂肪酸[5]、生物堿[6-8]、揮發(fā)性成分[9]等;具有抗腫瘤[12]、抗氧化[13]、抗驚厥[14]、鎮(zhèn)痛[15]等藥理作用。為研究挖掘苗藥課幣有的使用價(jià)值,本文研究利用聚酰胺樹(shù)脂的氫鍵吸附作用,純化課幣有(kod bit vud)中水溶性黃酮的最優(yōu)工藝條件。

        1 實(shí)驗(yàn)器材

        1.1 儀器

        MS105DU分析天平(梅特勒)、DK-98-Ⅱ數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、L530R離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、UV-1800紫外分光光度儀(島津)等。

        1.2 試藥

        實(shí)驗(yàn)中用的藥材飲片,采購(gòu)于貴陽(yáng)太升藥材市場(chǎng),經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室劉曉龍老師鑒定為天南星科一把傘南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott.的塊莖;芹菜素對(duì)照品(廠家:貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司,CAS NO:520-36-5);實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的水均為蒸餾水,無(wú)水乙醇、三乙胺均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 水溶性黃酮含量的測(cè)定

        參照2015年版《中國(guó)藥典》一部天南星項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定[15]。

        2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

        精密稱取芹菜素對(duì)照品12.06 mg,置100 mL量瓶中,加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液使溶解,并定容至刻度,搖勻,精密量取該溶液1 mL,于10 mL量瓶中,加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液至刻度,搖勻,即得濃度為12.06 μg·mL-1的溶液。

        2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        精密量取對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL,分別置10 mL量瓶中,各加60%乙醇溶液至5 mL,加1%三乙胺溶液至刻度,搖勻,以相應(yīng)試劑為空白,按照紫外-可見(jiàn)分光光度法(通則0401),在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),芹菜素濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性回歸方程為:y=0.059x+0.0056,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,線性范圍為2.412~12.06 μg·mL-1。

        2.2 水溶性黃酮純化工藝優(yōu)選

        2.2.1 水溶性黃酮溶液的制備

        取藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)12.0 g,精密稱定,加水240 mL,搖勻,在45 ℃的恒溫水浴鍋中加熱90 min,時(shí)時(shí)振搖;取出,放冷至室溫,離心(4000 r·min-1,10 min),取上清液;殘?jiān)偌铀?40 mL,在同樣條件下再提取一次;合并兩次上清液,加水至600 mL,搖勻,即得。

        2.2.2 聚酰胺樹(shù)脂預(yù)處理

        將聚酰胺樹(shù)脂用濕法裝柱后,先用95%乙醇沖洗至流出液置蒸發(fā)皿中蒸干無(wú)殘?jiān)?,再分別用80%乙醇溶液、60%乙醇溶液、40%乙醇溶液、20%乙醇溶液各3個(gè)柱體積沖洗,最后用蒸餾水沖洗,至流出液無(wú)醇味,即可。

        2.2.3 聚酰胺樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附考察

        取5 mL已處理的聚酰胺樹(shù)脂,以1 mL·min-1的流速加入水溶性黃酮溶液,溶液共計(jì)200 mL,收集流出液,每一個(gè)柱體積收集一份。將收集的流出液離心(4000 r·min-1,10 min),精密量取上清液2 mL,照2.1.2項(xiàng)下自“置10 mL量瓶中,加水至5 mL……”依法測(cè)定。以柱體積為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制聚酰胺樹(shù)脂動(dòng)態(tài)泄漏曲線,見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,上樣水溶性黃酮溶液5個(gè)柱體積,聚酰胺樹(shù)脂出現(xiàn)明顯的泄漏。

        圖1 聚酰胺動(dòng)態(tài)泄漏曲線Fig.1 Dynamic leakage curve of polyamide

        2.2.4 聚酰胺柱流速考察

        分別取5 mL已處理的聚酰胺樹(shù)脂于直徑為1.5 cm的層析柱中,分別以流速:1 mL·min-1、2 mL·min-1、3 mL·min-1、4 mL·min-1加入水溶性黃酮溶液溶液各70 mL,收集流出液,照2.2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定。繪制不同流速聚酰胺樹(shù)脂的泄漏曲線,見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,在直徑為1.5 cm的層析柱中,以1 mL·min-1的流速上樣,聚酰胺樹(shù)脂泄漏緩慢,即以流速/直徑比為0.67時(shí)上樣,動(dòng)態(tài)吸附能力最優(yōu)。

        圖2 不同流速聚酰胺泄漏曲線Fig.2 Polyamide leakage curves of different flow rates

        2.2.5 洗脫溶劑考察

        依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇濃度,以流速1 mL·min-1洗脫上樣的聚酰胺柱各3個(gè)柱體積,收集不同濃度下洗脫液,分別以相應(yīng)溶劑定容至25 mL,搖勻;照2.2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定繪制洗脫曲線。見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示,以乙醇濃度為60%的溶液洗脫,黃酮的累積洗脫量最高,故選擇60%乙醇溶液洗脫劑。

        圖3 洗脫溶劑考察Fig.3 Investigation on the elution solvent

        2.3 二次上樣的理論計(jì)算

        根據(jù)圖1可知,連續(xù)上樣原液5個(gè)柱體積以后,聚酰胺層析柱吸附速率出現(xiàn)明顯下降,泄漏量增多,但層析柱還保有較多的吸附能力,本實(shí)驗(yàn)嘗試對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)動(dòng)態(tài)泄漏曲線的結(jié)果,在上樣的每一時(shí)刻,將流出液重新加入層析柱中,由于流出液中目標(biāo)物質(zhì)濃度較低,使得該濃度下單位柱體積目標(biāo)物的量低于此時(shí)的吸附速率,那么理論上就不會(huì)有發(fā)生泄漏,從而流出液不必再做回收處理。如表1表2所示,上樣原液9個(gè)柱體積原液時(shí),可最大限度利用樹(shù)脂的吸附能力;當(dāng)上樣原液10個(gè)柱體積時(shí),采用二次上樣方法,聚酰胺樹(shù)脂理論上開(kāi)始泄漏。

        表1 一次上樣動(dòng)態(tài)泄漏Tab.1 Dynamic leakage of the first sample loading

        表2 二次上樣理論泄漏量Tab.2 Theoretical leakage of the second sample loading

        2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

        2.4.1 樣品溶液的制備及含量測(cè)定

        精密稱取藥材粉末(過(guò)二號(hào)篩)20.0123 g,加水400 mL,混勻,置于45 ℃的恒溫水浴鍋中加熱90 min,時(shí)時(shí)振搖;取出,放冷至室溫,離心10 min(4000 r·min-1),取上清液,另存;殘?jiān)铀?00 mL,在同一條件下重復(fù)提取一次;合并兩次上清液,加水至1000 mL,搖勻,即得。精密量取其溶液2 mL,依法測(cè)定吸光度。結(jié)果以芹菜素計(jì),溶液中黃酮含量為23.84 mg。樣品總膏重為4.4560 g,樣品含量為0.54%。

        2.4.2 聚酰胺樹(shù)脂的純化

        取110 mL聚酰胺樹(shù)脂于直徑為5.5 cm的層析柱中,用5倍柱體積蒸餾水沖洗,以3.7 mL·min-1的流速(流速/直徑為0.67),加入樣品溶液共計(jì)950 mL(約9倍柱體積),收集流出液,混合均勻,重新上樣到層析柱中;收集流出液,混合均勻,精密量取2 mL,依法測(cè)定吸光度為0.0810,說(shuō)明流出液無(wú)目標(biāo)物。

        以60%乙醇溶液作洗脫溶劑,以一個(gè)柱體積為單位收集洗脫液,分別精密量取洗脫液2 mL,依法測(cè)定繪制曲線,見(jiàn)圖4。結(jié)果表明5個(gè)柱體積洗脫效果較好。

        圖4 洗脫溶劑體積考察Fig.4 Investigation on the volume of the elution solvent

        純化后的樣品總量為48.0 mg;以相同方法測(cè)定吸光度,以芹菜素計(jì),黃酮含量為18.86%,純度提高了34倍。

        3 討論

        運(yùn)用聚酰胺樹(shù)脂純化苗藥課幣有中水溶性黃酮,最優(yōu)條件為:采用二次上樣的方法,原液上樣9個(gè)柱體積,流速/直徑比為0.67,以60%乙醇溶液作洗脫劑,洗脫5個(gè)柱體積。經(jīng)放大22倍驗(yàn)證,二次上樣后幾乎無(wú)目標(biāo)物泄漏,水溶性黃酮含量比純化前提高了34倍。

        運(yùn)用二次上樣的方法,能最大程度上利用樹(shù)脂和樣品,減少對(duì)流出液的后續(xù)處理步驟,極大提高了純化效率。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)聚酰胺對(duì)課幣有中水溶性黃酮進(jìn)行富集與純化,為下一步更深入的研究奠定了基礎(chǔ)。

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