陳夢婷，魯元星，張力，唐玲*

1重慶醫(yī)科大學附屬康復醫(yī)院神經康復科，重慶 400050；2重慶醫(yī)科大學附屬大學城醫(yī)院體檢中心，重慶 401331；

3重慶醫(yī)科大學病理生理學教研室，重慶 400016

睡眠是大腦的高級功能，充足的睡眠是健康的基本條件。睡眠障礙可影響機體固有的生物節(jié)律，出現認知、情緒、免疫功能改變及體內激素、遞質的變化，還可能引發(fā)其他器官系統(tǒng)疾病[1-3]。目前有研究認為，睡眠障礙是一種神經興奮/抑制功能失衡導致的臨床疾病[4]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)及谷氨酸(glutamate，Glu)是中樞神經系統(tǒng)內最重要的抑制/興奮性神經遞質，不同腦區(qū)的GABA、Glu含量以及相關受體參與了不同時期的睡眠轉換，在睡眠中發(fā)揮著非常重要的作用[5]。越來越多的證據表明，瘦素等調節(jié)食欲的因子與睡眠時間也有密切關聯。瘦素是一種主要由白色脂肪組織合成分泌的多肽類激素，主要作用于下丘腦弓狀核區(qū)域，在調節(jié)糖、脂肪的能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。瘦素基因缺乏小鼠常表現為睡眠結構及節(jié)律紊亂，睡眠轉換次數增加，而體內補充瘦素可增加睡眠深度[8]。但瘦素影響睡眠的機制目前尚不十分清楚。本研究利用多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪小鼠模型，研究瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦氨基酸類神經遞質及相關通路蛋白的影響，探討瘦素影響睡眠的可能機制，旨在為臨床睡眠障礙的治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料 SPF級6周齡雄性C57BL/6J小鼠24只，體重(20±5) g，購自重慶醫(yī)科大學，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學動物中心，給予充足的飲用水和飼料，每只小鼠飼養(yǎng)在規(guī)格為25 cm×15 cm×14 cm的鼠籠中。小鼠飼養(yǎng)符合標準實驗室條件：室溫(22±2) ℃，光照周期12 h/12 h。實驗開始前飼養(yǎng)7 d使小鼠充分適應飼養(yǎng)條件。所有動物實驗均符合并且嚴格遵守中國動物保護協會的準則。瘦素(美國Genscript公司，批號：Z03158-5)；GABA受體(GABAARα1)抗體(英國Abcam公司，貨號Ab109364)；谷氨酸脫羧酶67(glutamic acid decarboxylase-67，GAD67)抗體(美國Proteintech公司，貨號BC002815)；GAPDH內參抗體(美國Proteintech公司，貨號BC004109)。GABA、Glu的ELISA檢測試劑盒購自武漢Cloud-Clone Corp公司(貨號CEA900Ge、CES122Ge)，瘦素ELISA試劑盒購自武漢博士德公司(貨號AD2760MO)；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 睡眠剝奪模型的建立及分組 采用改良多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪動物模型[9]。將實驗小鼠放置于水平臺睡眠剝奪箱內(50 cm×35 cm×18 cm)，內含9個圓形小平臺(高10.0 cm，直徑1.5 cm，高于水面以上0.5 cm)，水溫保持在18～20 ℃，平臺均間隔4.0 cm；利用小鼠畏水以及在水中無法進入睡眠的生活習性，讓小鼠站立在平臺上，當小鼠進入快動眼睡眠期(REM)時，因全身肌張力降低引起低頭、觸水，以此來達到睡眠剝奪的目的。小鼠可自由從一個平臺跳躍到另一個平臺來實現自由走動，但不能同時跨立在兩個平臺上。各組小鼠均可自由獲取食物及飲用水。實驗開始前先將小鼠適應性飼養(yǎng)1周，采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、睡眠剝奪組、瘦素補充組，每組8只。對照組設置水環(huán)境不剝奪睡眠；睡眠剝奪組利用改良多平臺水環(huán)境法建立小鼠睡眠剝奪模型[10]，每天睡眠剝奪20 h，連續(xù)剝奪7 d；瘦素補充組在每次剝奪當天8:00 am及8:00 pm予以瘦素1.3 mg/(kg·d)腹腔給藥；對照組小鼠活動及睡眠不受任何干擾。

1.3 各組小鼠外周血瘦素水平檢測 建模成功后，取每組小鼠各8只，先將10%的肝素(0.1 ml/10 g)注入腹腔，15 min后采血，為使血液不易凝固，乙醚麻醉后快速摘去眼球取血液標本于1 ml EP管中，4 ℃離心15 min(3000 r/min)，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定瘦素含量。

1.4 各組小鼠下丘腦中GABA及Glu水平檢測 末次給藥30 min取血完成后，將小鼠斷頭處死，快速剝離腦組織，以視交叉為前界、乳頭體為后界、左右下丘腦溝為側界確定下丘腦位置，取1 mm深度左右的下丘腦組織，用生理鹽水沖洗下丘腦表面的殘余血液，用濾紙吸出表面多余的水分。按組織重量:生理鹽水為1:9的比例制備下丘腦10%組織勻漿，離心(4 ℃，12 000×g，10 min)獲取上清液。根據試劑盒說明書的方法檢測組織上清液中的GABA、Glu水平。

1.5 Western blotting檢測各組小鼠下丘腦GABAARα1、GAD67蛋白含量 末次給藥后30 min取小鼠下丘腦樣品稱重。按重量體積比例(1:9)向樣品中添加預冷裂解緩沖液，混合均勻后在冰上超聲勻漿，研磨至渾濁狀態(tài)后冰上靜置1 h。待組織充分溶解后在4 ℃超低溫離心機中對勻漿液進行離心(12 000 r/min，15 min)，收集上清液。腦組織中蛋白質濃度采用BCA法測定，目標蛋白質行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉移到PVDF膜上1 h。然后用封閉緩沖液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)封閉2 h，將封閉緩沖液棄去，采用3% BSA-TBST稀釋一抗，GABAARα1按比例1:2000稀釋成4 ml，GAD67按比例1:2000稀釋成4 ml，4 ℃孵育過夜。第2天取出PVDF膜，室溫孵育30 min。TBST洗膜10 min×3次。采用BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)用HRP按1:4000稀釋，室溫輕搖60 min。TBST洗膜15 min×3次，最后加入ECL超敏化學發(fā)光液以顯色。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據以表示，在滿足方差齊性的條件下，多組樣本均數間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 睡眠剝奪對小鼠體重及血漿瘦素水平的影響睡眠剝奪前，對照組與睡眠剝奪組小鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。從實驗開始后的第1天，睡眠剝奪組小鼠體重逐漸減輕。在睡眠剝奪4、7 d后，睡眠剝奪組小鼠體重[分別為(18.28±0.44) g，(17.75±0.75) g]較對照組[分別為(21.71±0.71) g，(22.03±0.42) g]明顯減輕(P<0.05，P<0.01)，瘦素補充組體重[分別為(17.07±0.25) g，(15.10±0.38) g]較對照組及剝奪組小鼠均明顯減輕(P<0.01，P<0.05)。睡眠剝奪組小鼠皮毛失去光滑，表現出一定興奮性行為，對光線和聲音特別敏感，表現輕微躁狂，攻擊性強，提示造模成功。ELISA檢測結果顯示，睡眠剝奪組小鼠血漿瘦素水平[(359.14±16.69) pg/ml]明顯低于對照組[(483.81±21.72) pg/ml]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而瘦素補充組小鼠血漿瘦素水平[(1124.00±19.87) pg/ml]明顯高于對照組和睡眠剝奪組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.2 外源性補充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦GABA、Glu水平的影響 ELISA檢測結果顯示，與對照組[(152.37±8.14) ng/g]相比，睡眠剝奪組小鼠下丘腦GABA水平[(111.31±2.96) ng/g]明顯降低(P<0.01)；瘦素補充組小鼠下丘腦GABA水平[(132.19±3.38) ng/g]明顯高于睡眠剝奪組(P<0.05)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；睡眠剝奪組、瘦素補充組小鼠下丘腦Glu水平[分別為(686.56±10.01) ng/g、(668.64±9.93) ng/g]明顯高于對照組[(577.11±16.36) ng/g，P<0.05]，而瘦素補充組與睡眠剝奪組Glu水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 外源性補充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦GAD67、GABAARα1蛋白表達的影響 Western blotting檢測結果顯示，與對照組(1.09±0.13)相比，睡眠剝奪組小鼠下丘腦中GAD67表達(0.68±0.06)明顯降低，而瘦素補充組小鼠下丘腦中的GAD67水平(1.39±0.19)較睡眠剝奪組及對照組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組(0.99±0.07)比較，睡眠剝奪組小鼠下丘腦GABAARα1表達水平(0.69±0.07)明顯降低，而瘦素補充組小鼠下丘腦GABAARα1水平(1.33±0.14)明顯高于睡眠剝奪組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1)。

3 討 論

睡眠、能量代謝及晝夜節(jié)律系統(tǒng)經過幾百萬年的共同進化，使機體與環(huán)境的協調達到最佳狀態(tài)，并維持多種分子與生理過程間的內部協調。大量研究證實，能量平衡與睡眠-覺醒密切相關，而瘦素是聯系睡眠-覺醒周期與能量平衡的關鍵分子[11]。

圖1 各組小鼠下丘腦GAD67、GABAARα1蛋白表達(Western blotting)Fig.1 Expressions of GAD67 and GABAARα1 protein in hypothalamus of each group of mice (Western blotting)

瘦素是白色脂肪合成的多肽類激素，主要發(fā)揮控制食欲、促進能量消耗的作用。瘦素分泌進入血液后，部分與瘦素結合蛋白結合，通過血腦屏障進入腦組織并與其多種形式的瘦素受體結合發(fā)揮作用[12]。瘦素受體廣泛分布于大腦，其中部分表達瘦素受體的神經核團與睡眠覺醒相關的神經核團重疊。在下丘腦外側區(qū)，瘦素反應性GABA能神經元的一個子集投射至促覺醒神經元(orexin能神經元)，這表明瘦素反應性神經元可通過抑制orexin能神經元而發(fā)揮促睡眠作用[13]。人體的瘦素分泌具有晝夜節(jié)律，表現為夜間分泌逐漸增多，至清晨達最高峰，白天分泌減少[14]。有學者發(fā)現，睡眠不足或紊亂的患者瘦素水平、峰值、升降幅度均明顯下降，而在正常睡眠恢復后瘦素水平又會升高[15-16]。瘦素基因缺陷的小鼠也表現為睡眠微覺醒次數增加，睡眠期轉換次數增加[17]，而將人源重組瘦素注入大鼠體內后慢波睡眠比例增加，睡眠質量和結構明顯改善[18]。本研究中，與對照組相比，睡眠剝奪組小鼠體重明顯減輕，血清瘦素水平明顯降低。由此可見，無論在人體還是動物中，睡眠時間與瘦素水平均有著極為密切的關系。

睡眠剝奪對人體的生理功能影響廣泛，特別是對中樞神經系統(tǒng)產生的影響更為明顯[19]。研究顯示，在睡眠剝奪期間，大鼠的攝食量明顯增加，但體重卻有所下降，表明睡眠剝奪期間的大鼠處于高能量消耗狀態(tài)。隨著睡眠剝奪時間的延長，大鼠的生理變化更加明顯，10 d后會因全身衰竭而落水死亡[20]。為了更有效地觀察睡眠剝奪引起的生理變化，為睡眠機制研究提供更客觀的依據，本研究采用改良多平臺水環(huán)境法建立睡眠剝奪模型，以7 d為睡眠剝奪周期，設計水環(huán)境無睡眠剝奪為對照組，對下丘腦主要的興奮/抑制性神經遞質進行檢測及分析。結果顯示，睡眠剝奪可導致下丘腦內興奮性神經遞質Glu明顯增多而抑制性神經遞質GABA明顯減少；補充瘦素對睡眠剝奪小鼠下丘腦內Glu水平無明顯影響，但可顯著提升GABA水平，提示瘦素主要通過調節(jié)抑制性神經遞質GABA而發(fā)揮睡眠調節(jié)作用。相關研究表明，GABA是中樞神經系統(tǒng)中最重要的抑制性神經遞質，睡眠促進神經元系統(tǒng)幾乎均由GABA能神經元組成，在睡眠中發(fā)揮著極為關鍵的調控作用[4]。近年來研究發(fā)現，外源性補充GABA可通過增加腦部慢波從而提高睡眠中的深睡眠比例來改善睡眠質量[5]。因而，提升GABA含量可能是瘦素參與調節(jié)睡眠的重要機制。

腦內的GABA主要是由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶作用脫羧而成，在谷氨酸脫羧酶的作用下，將谷氨酸轉化為GABA[21]。谷氨酸脫羧酶以GAD65及GAD67兩種亞型形式存在[22-23]。研究表明，GAD67比GAD65對GABA的變化更敏感，GAD67負責大腦中超過90%的GABA合成及釋放，普遍存在于GABA能神經元胞質中，主要負責GABA的合成[24-26]。本研究結果發(fā)現，瘦素在提高下丘腦內GABA含量的同時，上調了GAD67蛋白的表達水平，這提示瘦素可能通過上調GABA合成酶的表達而提高GABA的含量。

GABA主要通過與其受體特異性結合而在突觸之間快速產生抑制作用。因此，GABA發(fā)揮抑制效應不僅需要上游神經元正常獲取及釋放GABA神經遞質，也需要下游神經元具有相應數量的GABA受體以完成信息的傳遞[27-28]。GABAA受體是失眠研究中的常用指標，其中A受體以GABAARα1亞型最多[29]。有研究表明，在對氯苯丙氨酸造模的失眠大鼠模型中，GABA及GABAARα1的表達會明顯減少[30]。同樣本研究的動物模型也表明，睡眠剝奪導致小鼠GABAARα1表達降低，而瘦素可明顯上調睡眠剝奪小鼠下丘腦內GABAARα1受體的表達。這一調節(jié)效應也將增強對GABA抑制性神經信號的傳遞，可能在瘦素對睡眠結構的調節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，瘦素可上調睡眠剝奪小鼠下丘腦內GABA關鍵合成酶GAD67的表達、升高下丘腦GABA含量、提高下丘腦GABAARα1蛋白表達水平，進而影響失眠小鼠的睡眠情況。雖然對瘦素作用于GABA神經元的詳細下游分子機制仍需進一步深入探討，但本研究結果提示，瘦素可能是通過調節(jié)GABA的合成及信號傳遞從而參與睡眠調控的，為睡眠-覺醒機制與能量代謝研究提供了新資料。