周靜 崔春平 李蕊 王婧琪 孫曉渤 盧婷婷 王玉鴿 邱偉

血管周邊星形膠質(zhì)細(xì)胞的水通道蛋白-4抗體（aquaporin-4 immunoglobulin G antibodies，AQP4-IgG）在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（neuro myelitis optica spectrum disorder,NMOSD）中的陽性率高達(dá)75%～90%[1]。故AQP4-IgG已作為NMOSD重要診斷條件，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AQP4-IgG還有助于提示炎癥性脫髓鞘疾病首次臨床發(fā)作后向NMOSD轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]，包括孤立雙側(cè)視神經(jīng)炎（optic neuritis，ON）、急性橫貫性脊髓炎等。但在少數(shù)高度懷疑NMOSD患者，AQP4-IgG初始檢測結(jié)果為陰性，而后期隨訪可能轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃訹5]。因此，有學(xué)者指出，AQP4-IgG陽性率可能受諸多因素影響，部分血清陰性患者的抗體滴度可能低于目前可用的檢測閾值，即出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果[6-8]。近期報(bào)告，部分AQP4-IgG陰性的NMOSD患者[1,9]，存在抗髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白 (myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)抗體[10]，或其他可能致病性抗體[9,11-12]。既往國外研究主要集中在單次檢測血清AQP4-IgG陰性NMOSD患者的預(yù)后和復(fù)發(fā)分析[13-15]，缺乏血清AQP4-IgG動態(tài)變化及臨床轉(zhuǎn)歸的前瞻性報(bào)告。本研究旨在建立一組首測血清AQP4-IgG陰性的NMOSD的臨床數(shù)據(jù)，動態(tài)記錄不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)AQP4-IgG轉(zhuǎn)換結(jié)果及患者的診斷與臨床轉(zhuǎn)歸。

1 對象與方法

1.1 研究對象對中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)科15例首次血清AQP4-IgG檢測陰性的NMOSD患者，包括孤立雙側(cè)視神經(jīng)炎、脊髓炎等患者進(jìn)行前瞻性隨訪研究（2012年 11月至 2018年 4月）。AQP4-IgG陰性NMOSD入組標(biāo)準(zhǔn)如下：①在1次或多次臨床發(fā)作中，至少2項(xiàng)核心臨床特征并滿足下列全部條件：至少l項(xiàng)臨床核心特征為復(fù)發(fā)性O(shè)N，急性脊髓炎或延髓最后區(qū) (area postrema syndrome，AP)綜合征；空間多發(fā)；MRI表現(xiàn)符合臨床癥狀；②血清AQP4-IgG檢測采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染免疫熒光法（cell based assay,CBA）；③排除其他診斷。核心臨床癥狀:①復(fù)發(fā)性O(shè)N；②急性脊髓炎（acute transverse myelitis,ATM）；③AP 綜合癥；④其他腦干綜合征；⑤癥狀性發(fā)作性睡病、間腦綜合征、腦MRI有NMOSD特征性間腦病變；⑥大腦綜合征伴有NMOSD特征性大腦病變。排除標(biāo)準(zhǔn)；①首次檢測AQP4-IgG陽性；②急性播散性腦脊髓炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）感染、CNS代謝性疾病、CNS血管炎等。臨床復(fù)發(fā)定義為：①在病情穩(wěn)定1個月以上突發(fā)神經(jīng)功能惡化；②腦或脊髓MRI增強(qiáng)中發(fā)現(xiàn)新病灶。兩個獨(dú)立的神經(jīng)病學(xué)專家對所有患者按上述的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[5,16-17]。本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均獲得知情同意。

1.2 研究方法前瞻性隨訪，收集患者臨床資料，包括年齡、性別、脫髓鞘事件數(shù)、每次復(fù)發(fā)的臨床特征、實(shí)驗(yàn)室及影像結(jié)果、治療用藥等。

1.3 血清AQP4-IgG檢測由兩位獨(dú)立的研究人員通過CBA法對商業(yè)生物芯片試劑盒（Euroimmun，Germany）的抗AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞系進(jìn)行了盲法診斷[18]。在隨訪過程中，采用同樣檢測方法，由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院神經(jīng)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)檢測?？贵w滴度1:10或更高定義為AQP4-IgG陽性。實(shí)驗(yàn)步驟簡述如下：血清（1:10）在磷酸鹽緩沖鹽水(Phosphate-buffered saline,PBS）中稀釋。稀釋后的樣品在室溫下與生物芯片載玻片上的AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞反應(yīng)30 min。然后用PBS沖洗兩次載玻片，再用熒光素結(jié)合山羊抗人IgG孵育30 min，最后用PBS沖洗載玻片，用顯微鏡測量熒光。稀釋度為1:10時(shí)呈陰性的血清在1:4、1:32和1:120時(shí)檢測。通過對AQP4轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)的染色，證實(shí)了陽性反應(yīng)，但在同一樣本中，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有染色。將陽性樣品滴定至1:1000（血清），以確定產(chǎn)生陽性結(jié)果的最高稀釋度。對陰性樣品，采用非稀釋法再次記錄檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 16.0進(jìn)行分析。分類數(shù)據(jù)用百分比表示，實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)用稀釋比表示。

2 結(jié)果

2.1 首次檢測AQP4-IgG陰性NMOSD人口統(tǒng)計(jì)學(xué)與臨床特征首次檢測AQP4-IgG陰性NMOSD組人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征見表1。女性11例，男性4例。平均隨訪時(shí)間67（19～176）個月。發(fā)病年齡 37（16～65）歲。第一次發(fā)作單純 AP3例；ON5例；同時(shí)AP和ATM4例；同時(shí)ON和ATM3例；可見ON癥狀起病最多見（8例）。

血清學(xué)檢測風(fēng)濕免疫抗體，4例抗核抗體或抗SSA抗體陽性。腦脊液檢測白細(xì)胞異常3例，蛋白增高3例，腦脊液寡克隆帶弱陽性1例。腦及脊髓MRI表現(xiàn)：視神經(jīng)異常2例，延髓異常8例，脊髓異常12例（主要分布于頸、胸髓）。

15例患者均行血清MOG-IgG檢測，其中1例陽性 （病例1），該患者為47歲，女性，符合AQP4-IgG陰性的NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)；發(fā)病20個月后，MOG-IgG復(fù)查轉(zhuǎn)為陰性。該患者合并抗核抗體陽性（滴度1:100）。

2.2 AQP4-IgG動態(tài)演變、復(fù)發(fā)與治療情況15例首次AQP4陰性NMOSD患者中，4例（27%）隨訪中 AQP4-IgG 陰性轉(zhuǎn)為陽性 （病例 1、2、8、15），其中病例1在陰性和陽性之間波動，病例2持續(xù)陽性，病例 8及 15又轉(zhuǎn)為陰性；2例（病例 5、10）采用血清非稀釋的CBA法檢測，發(fā)現(xiàn)滴度為極低陽性（滴度1:1）；剩余9例（60%）患者在隨訪中持續(xù)檢測均為陰性。在動態(tài)監(jiān)測AQP4-IgG至少3次以上的10例患者中，第二次檢測為陰性者后面復(fù)查均為陰性（病例 3、6、9、12、13、14），第二次為陽性或血清不稀釋極低陽性者，后面復(fù)查均檢測過陽性（病例 1、2、8、15）。

隨訪觀察，6例（40%）出現(xiàn)1至2次臨床復(fù)發(fā)（病例 1、2、8、10、11、15）。在上述 4 例 AQP4-IgG陰性轉(zhuǎn)陽性患者中，3例（病例 1、2、15）在陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘臅r(shí)間節(jié)點(diǎn)無臨床復(fù)發(fā)，1例在時(shí)間節(jié)點(diǎn)出現(xiàn)復(fù)發(fā)（病例8）；同時(shí)，9例持續(xù)陰性患者中，1例（病例11）出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。

后續(xù)隨訪，患者診斷修正為AQP4-IgG陽性NMOSD （4 例），MS （1 例）， 持續(xù)陰性 NMOSD（6例），ATM（3 例），ON（1例）。12例患者接受免疫抑制劑治療，包括硫唑嘌呤（9例）、霉酚酸酯治療（4例）、利妥昔單抗（2 例）。

表1 15例首次檢測血清AQP4-IgG陰性NMOSD患者的臨床特征

3 討論

AQP4-IgG血清學(xué)陰性的NMOSD患者臨床存在較大異質(zhì)性。血清學(xué)AQP4-IgG陰性的NMOSD和其他未分類的AM-IDD的精確診斷和治療目前仍然具有挑戰(zhàn)性。我們研究表明，隨著疾病病程的演變，患者血清AQP4-IgG可以在陰性和陽性之間轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致疾病診斷及臨床轉(zhuǎn)歸改變。既往研究表明，NMOSD患者血清AQP4-IgG水平與疾病活動程度相關(guān)，抗體陽性患者比陰性患者更容易復(fù)發(fā)[19-20]。WEINSTOCK 等[20]提出，活動期患者血清AQP4-IgG陽性，而穩(wěn)定或長期免疫抑制劑治療患者血清AQP4-IgG陰性。因此，血清AQP4-IgG的檢測可作為臨床觀察疾病活動或療效監(jiān)測的生物標(biāo)記物。然而，在我們隨訪的15例AQP-IgG陰性患者中，部分患者AQP4-IgG從陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃缘臅r(shí)間節(jié)點(diǎn)卻無臨床復(fù)發(fā)，同時(shí)檢測陰性患者也可出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。因此，抗體是否呈陽性并不一定與疾病復(fù)發(fā)直接相關(guān)。在臨床實(shí)踐中，血清AQP4-IgG陽性不能作為預(yù)測NMOSD復(fù)發(fā)的唯一指標(biāo)。CHANSON等[21]報(bào)告，血清AQP4-IgG滴度的顯著升高與疾病損傷程度的恢復(fù)和惡化無關(guān)[21]。

既往研究表明，使用硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺和利妥昔單抗等免疫抑制劑后，NMOSD患者的AQP4-IgG水平顯著降低[5,22-23]。在本研究中隨訪，并未觀察到AQP4-IgG水平與免疫抑制劑治療之間的相關(guān)性。如病例8，利妥昔單抗治療過程中，AQP4-IgG由陰性轉(zhuǎn)為陽性；病例15，使用嗎替麥考酚酯治療后病情穩(wěn)定，而復(fù)檢AQP4-IgG轉(zhuǎn)為陽性。不過由于本研究樣本較少，AQP4-IgG血清水平與免疫抑制劑使用的相關(guān)結(jié)果尚需進(jìn)一步論證。臨床研究中，ON可以轉(zhuǎn)換成MS或NMOSD[24]。西方人群中80%的復(fù)發(fā)性O(shè)N患者AQP4-IgG抗體陰性，本研究中一例血清AQP4-IgG陰性的復(fù)發(fā)性O(shè)N患者在隨訪中轉(zhuǎn)為陽性。因此，復(fù)發(fā)性O(shè)N患者仍需注意定期檢測AQP4-IgG，因?yàn)榭贵w檢測的結(jié)果可能影響疾病的診斷、治療及預(yù)后。

有報(bào)告AQP4-IgG陰性的NMOSD患者合并MOG抗體陽性較高[10,14]，本研究資料也證實(shí)AQP4-IgG陰性組發(fā)現(xiàn)一例MOG抗體陽性者，但因本研究樣本量較少，還需進(jìn)一步論證。

本研究中，兩位獨(dú)立研究者在同一實(shí)驗(yàn)室使用同一測試方法對患者進(jìn)行測試，排除了因檢測方法不同導(dǎo)致結(jié)果的差異。在未來的研究中，應(yīng)該多中心、收集更大樣本，進(jìn)行前瞻性、隨機(jī)對照隨訪研究。

綜上所述，AQP4-IgG陰性NMOSD患者最常出現(xiàn)ON；動態(tài)監(jiān)測AQP4-IgG，至少2次及以上非常有必要；臨床隨訪中AQP4-IgG可能陰性轉(zhuǎn)為陽性，患者最終診斷及轉(zhuǎn)歸不同。