蔡 磊，尹春穎，尹德春

心力衰竭是全球疾病導(dǎo)致死亡的主要原因，其特點(diǎn)是因危險(xiǎn)因素而導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能受損[1]。尤其是舒張功能障礙已經(jīng)被認(rèn)為是心力衰竭的主要機(jī)制，其主要原因是心臟纖維化[2]。隨著心肌成纖維細(xì)胞的激活和增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原)的沉積增加，破壞了心肌結(jié)構(gòu)，反過來又導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)順應(yīng)性差，從而阻礙正常的心排血量[3]。心肌纖維化的機(jī)制已被深入研究。其中，轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是心肌纖維化過程中在成纖維細(xì)胞活化和增殖中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子[4]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的RNA，沒有編碼蛋白質(zhì)的能力[5]。揭示了LncRNA在心臟發(fā)育和疾病中的新作用[6]。Fendrr是新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，通過控制組蛋白H3K27乙?；瘉碚{(diào)節(jié)心臟的發(fā)育[7]。“勇敢的心”中，已顯示出心血管譜系中需要LncRNA表達(dá)[8]。Wisper富含心肌成纖維細(xì)胞的LncRNA并調(diào)節(jié)心臟成纖維細(xì)胞增殖[9]。GAS5拮抗微小RAN-21介導(dǎo)的心肌纖維化進(jìn)展[10]。H19抑制DUSP5來促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和纖維化[11]。這些研究表明，LncRNAs是心肌纖維化的重要調(diào)節(jié)因子。本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的LncRNA 1700020I14Rik，其在心臟組織中選擇性表達(dá)，并且在與纖維化相關(guān)的應(yīng)激心臟中受到抑制。LncRNA的過度表達(dá)抑制新分離的心臟成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，表明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的心肌病心肌纖維化的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地。所有動(dòng)物手術(shù)均經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)和大慶龍南醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主動(dòng)脈橫帶的制作 選擇成年SD雄性小鼠(12周)用于手術(shù)。用呼吸機(jī)麻醉和插管后，給小鼠行胸骨中線肌切開術(shù)顯露主動(dòng)脈，用6-0丙烯縫合線將頭臂動(dòng)脈遠(yuǎn)端的主動(dòng)脈與鄰近主動(dòng)脈放置的27號(hào)鈍針捆綁在一起，然后將結(jié)擰緊，小心地取出針，用可吸收縫線縫合胸部的皮膚閉合。術(shù)后1周采集心臟標(biāo)本。

1.2.2 心肌細(xì)胞分離 采用LangordFF灌流系統(tǒng)進(jìn)行分離。先給小鼠注射100 U肝素，然后殺死小鼠取出整個(gè)心臟。將心臟連接到套管，用無鈣灌注緩沖液灌注(113 mmol/L氯化鈉，4.7 mmol/L氯化鉀，0.6 mmol/L磷酸二氫鉀，0.6 mmol/L磷酸氫二鈉，1.2 mmol/L硫酸鎂，10 mmol/L羥乙基哌嗪乙磺酸鈉，12 mmol/L碳酸氫鈉，10 mmol/L碳酸氫鉀，0.032 mmol/L苯酚紅，30 mmol/L?；撬幔?0 mmol/L二苯甲烷雙馬來酰亞胺和5.5 mmol/L葡萄糖)。再用消化緩沖液(Ⅱ型膠原酶300 U/mL灌注緩沖液，50 μmol/L CaCl2)灌注心臟10～12 min，然后用鑷子將心臟分離以釋放細(xì)胞。將細(xì)胞懸液在20重力下離心3 min，收集心肌細(xì)胞。將懸浮液用CD31偶聯(lián)磁珠收集內(nèi)皮細(xì)胞，收集出的樣本作為原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行電鍍。

1.2.3 5-乙炔基-2′-脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測 根據(jù)EdU說明書使用iT EdU細(xì)胞增殖試劑盒進(jìn)行可視化。在每個(gè)田格(20×)中測定EdU陽性細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞增殖試驗(yàn) 在96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中鍍?nèi)胄呐K成纖維細(xì)胞。在培養(yǎng)基中加入20 μL 10 mg/mL噻唑藍(lán)細(xì)胞培養(yǎng)基。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，除去噻唑藍(lán)溶液，然后向井中加入100 μL二甲基亞砜，在室溫下溶解沉淀物10 min。使用PrimaMax M2微板閱讀器(分子器件)在540 nm處記錄吸光度。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR) 測定 RNA通過Trizol試劑(Invitrogen公司)分離，并根據(jù)制造商的指示用PrimeScript RT Master Mix(Clontech)進(jìn)行互補(bǔ)DNA(cDNA)合成。根據(jù)制造商的說明(Roche)，使用SYBR Green PCR母體混合物，使用StepOne/StepOnePlusTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))測定轉(zhuǎn)錄水平。引物序列如下，1700020I14Rik：GGGACAATGCTCACCCTGAA和TCCAACCCAGTCACTGC；肌球蛋白重鏈6(Myh6)：GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC；肌球蛋白重鏈7(Myh7)：ACTGTCAACACTAAGAGGGTCA和TTGGATGATTTGATCTTCCAGGG；肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(Serca2a)：GAGAACGCTCACACAAAGACC和CAATTCGTTGGAGCCCCAT；腦鈉肽(BNP)：GAGGTCACTCCTATCCTCTGG和GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC；心鈉素(ANP)：GCTTCCAGGCCATATTGGAG和GGGGGCATGACCTCATCTT；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)：GTCCCAGACATCAGGGAGTAA和TCGGATACTTCAGCGTCAGGA；Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)：GCTCCTCTTAGGGGCCACT和CCACGTCTCACCATTGGGG；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)：CTGGACAGCCAGACACTAAAG和CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG。

2 結(jié) 果

2.1 LncRNA 1700020I14Rik在心臟中富集情況 利用EnCODE數(shù)據(jù)庫[12]，發(fā)現(xiàn)小鼠心臟中H3K4三甲基化高度富集，提示該基因是主動(dòng)轉(zhuǎn)錄的。事實(shí)上，在這個(gè)區(qū)域的心臟樣品中發(fā)現(xiàn)了作為LncRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1700020I14Rik(見圖1A)。為了驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫結(jié)果，確定了其在心臟發(fā)育過程中的表達(dá)。LncRNA在胚胎心臟中低水平表達(dá)，在成年心臟中高表達(dá)。在成年小鼠的心臟中，LncRNA水平是胚胎心臟的8倍(見圖1B)。其只在心臟中高度表達(dá)，而不是在肺、肝、腎和胸腺等其他組織中高表達(dá)(見圖1C)。

與胚胎10 d比較，＊P<0.001；與心臟比較， #P<0.05。

2.2 LncRNA 1700020I14Rik在應(yīng)激心臟中被抑制 本研究在成年雄性小鼠中應(yīng)用橫向主動(dòng)脈帶。ANP、BNP、Myh7升高，Myh6、Serca2a降低，這是心臟肥大的標(biāo)志物[13-14](見圖2A、圖2B)。本研究發(fā)現(xiàn)在心臟中LncRNA的表達(dá)被帶狀抑制(見圖2C)，提示LncRNA可能參與心臟重塑過程。本研究測定分離的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中LncRNA水平，沒有觀察到心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA的下調(diào)。然而，LncRNA水平在成纖維細(xì)胞中下調(diào)(見圖2D)。

與Sham組比較，＊P<0.05，#P<0.01，△P<0.001。

2.3 LncRNA 1700020I14RiK抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖 在建立了病變心臟的表達(dá)變化后，檢測其在心肌肥厚過程中的功能和機(jī)制。采用小鼠離體心臟成纖維細(xì)胞模型，將LncRNA的cDNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，用TGF-β成功地誘導(dǎo)了心肌成纖維細(xì)胞增殖(見圖3A)。相比之下，LncRNA過表達(dá)抑制了DNA合成，由成纖維細(xì)胞中的EdU摻入來表示(見圖3A、圖3B)。這一觀察結(jié)果證實(shí)了受損的增殖(見圖3C)。同樣，成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA也被LncRNA過表達(dá)抑制(見圖3D)。膠原蛋白也受到了LncRNA過表達(dá)的抑制(見圖3E)。此外，TGF-β誘導(dǎo)的MMP-9也受到LncRNA過表達(dá)的抑制(見圖3F)。表明LncRNA在心肌成纖維細(xì)胞激活和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中具有抑制作用。

與Vector組比較，＊P<0.01，#P<0.001。

3 討 論

纖維化是心力衰竭病人心功能損害的主要原因，主要通過心肌成纖維細(xì)胞的激活和增殖介導(dǎo)。細(xì)胞自主性和非自主性機(jī)制如何激活心肌成纖維細(xì)胞，對于理解心力衰竭時(shí)的心臟重構(gòu)至關(guān)重要[15]。本研究闡述了心臟應(yīng)激使心肌成纖維細(xì)胞中一個(gè)新的LncRNA 1700020I14Rik減少。其在心肌成纖維細(xì)胞中的恢復(fù)表達(dá)抑制了成纖維細(xì)胞的增殖。在最近的研究中，已經(jīng)揭示了LncRNA 1700020I14Rik在糖尿病腎病模型中的作用[16]。間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病中普遍存在的病理現(xiàn)象，伴有大量細(xì)胞外基質(zhì)積聚[17]。在糖尿病腎病小鼠中也觀察到LncRNA 1700020I14Rik下調(diào)[16]。提示LncRNA 1700020I14Rik參與的纖維化過程不僅僅局限于心臟纖維化。心臟纖維化遵循與肺、肝、皮膚和腎等其他器官類似的途徑[18]。因此，LncRNA 1700020I14Rik還應(yīng)參與發(fā)生于其他器官的纖維化。 LncRNAs通?？刂葡噜徎虮磉_(dá)[19]。LncRNA 1700020I14Rik位于鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶樣EF手蛋白1(Chp1)的下游，Chp1是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的抑制劑[20]。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶主要促進(jìn)心臟肥大和衰竭[21]，提示LncRNA 1700020I14Rik通過調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性與心力衰竭有關(guān)。但應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行其細(xì)胞定位和附近基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。研究還表明，LncRNA 1700020I14Rik具有海綿樣作用，可抑制microRNA-34a-5p介導(dǎo)的HIF1α信號(hào)通路[16]。microRNA-34a確實(shí)促進(jìn)心肌梗死期間的心肌纖維化。這些觀察表明LncRNA 1700020I14Rik介導(dǎo)心肌纖維化的類似機(jī)制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)一種新的抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖的LncRNA。其受心臟應(yīng)激下調(diào)，提示在應(yīng)激心臟重構(gòu)過程中心肌成纖維細(xì)胞活化和增殖的新機(jī)制。

LncRNA 1700020I14Rik是一種心肌富集型LncRNA，在應(yīng)激性心肌纖維化中表達(dá)下調(diào)。LncRNA 1700020I14Rik抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，表明其在抑制心肌纖維化中有一定作用。