焦華琛，鄭書敏，李運倫，高金超，張辛欣，鐘 霞

超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)是一類新近發(fā)現(xiàn)的由HCN1-4基因家族編碼的離子通道[1]。HCN通道由4個不同的亞基構成復合體[2]，參與編碼超極化激活陽離子電流(If)通道結構蛋白[3]，是心臟動作電位緩慢舒張期自動去極化的重要部分，具有調控心臟起搏的功能。前期研究顯示，If與心房顫動的發(fā)生及維持關系密切[4]。本研究觀察心房顫動大鼠心房肌HCN2、HCN4蛋白及其mRNA表達，以及青山健心片對兩種通道蛋白的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠80只，8周齡，體重(200±20)g，由山東大學動物中心提供，動物合格證號20184897。于山東省動物中心實驗動物室飼養(yǎng)。

1.2 藥物 青山健心片購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。將青蒿、常山按3∶1比例加入8倍重水兩次水提，濃縮，醇沉24 h，每毫升含生藥7.1 g，制成浸膏片，每片0.3 g，給藥時按比例進行稀釋。酒石酸美托洛爾，批號1704A13，阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片25 mg。

1.3 主要試劑與儀器[5]RNA提取液，購自Servicebio公司，批號G3013；HyPure Molecular Biology Grade Water，購自HyClone公司，批號SH30538.02；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自Thermo公司，批號#K1622；三氯甲烷，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號10006818；異丙醇，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號80109218；無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號10009218。

酶標檢測儀(Rt2100c，Rayto公司)；磁力攪拌器(MS-PB，Servicebio公司)；勻漿儀(KZ-Ⅱ，康濤科技)；雙垂直電泳儀(DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；臺式高速冷凍型微量離心機(D3024R，DragonLab公司)；熒光定量PCR儀(Stepone plus，ABI公司)；超微量分光光度計(NanoDrop2000，Thermo公司)；標準試劑型純水儀(FBZ2001-up-p，青島富勒姆科技有限公司)。

1.4 模型制備、分組及干預方法[6]大鼠80只，隨機分為對照組、模型組、青山健心片組、美托洛爾組，每組20只。通過乙酰膽堿(Ach)-氯化鈣溶液多次給藥誘發(fā)大鼠陣發(fā)性心房顫動，模型組、青山健心片組、美托洛爾組每日舌下靜脈注射混合藥液0.1 mL/100 g(內(nèi)含CaCl25～10 mg/mL，Ach 33～66 μg/mL)，隔日給藥1次，共14次。對照組大鼠每日靜脈注射等體積的生理鹽水。造模時以心電圖顯示出現(xiàn)心房顫動為造模成功判定標準。造模成功后開始灌胃，對照組、模型組予以等體積的蒸餾水灌胃，青山健心片組、美托洛爾組劑量按照人-大鼠體表面積換算(1∶6.25)，青山健心片組灌胃劑量為2.01 g/kg，美托洛爾組灌胃劑量為0.52 mg/kg，共4周。給藥及造模過程中，模型組5只大鼠，對照組、青山健心片組、美托洛爾組各2只大鼠因心律失常死亡，總死亡率為13.70%。實驗時處死動物，取各組動物的左心房、左心室組織。

1.5 引物設計[7-8]使用Primer Premier 5.0軟件設計引物見表1。

表1 HCN2、HCN4基因PCR引物設計

1.6 觀察指標

1.6.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測HCN2、HCN4 mRNA表達[9]

1.6.1.1 總RNA提取 大鼠心房肌提取總RNA，溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，紫外分光光度計檢測吸光度(OD值)，A260/A280均在1.8～2.0，記錄總RNA濃度。

1.6.1.2 PCR擴增 按照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0操作。反轉錄反應，①按下列組成配制反轉錄反應液：MgCl22 μL、10 ×RT Buffer 1 μL、RNase Freed H2O 3.75 μL、dNTP Mixture(各10 mmol)1 μL、RNase In-hibitor 0.25 μL、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL、Oligo dT-Ada-ptor Primer 0.5 μL、RNA 1 μL，總體積為10 μL。②按以下條件進行反轉錄反應：42 ℃ 30 min、95 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min，循環(huán)1次。

1.6.1.3 PCR反應 ①按下列組成配制PCR反應液：5×PCR Buffer 10 μL、滅菌蒸餾水28．75 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0．25 μL、上游特異性PCR引物 0．5 μL、下游特異性PCR引物0．5 μL，總體積為40 μL。②將PCR反應液加入反轉錄反應結束后的PCR反應管中，輕輕混勻。③按以下條件進行PCR反應：94 ℃ 3 min、94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。電泳檢測：100 V電泳40 min，用Quantity Qne軟件對PCR產(chǎn)物條帶進行定量分析。

1.6.2 蛋白免疫印跡法(Western-Blot)檢測HCN2、HCN4蛋白表達

1.6.2.1 蛋白提取 用預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)將心臟組織塊洗滌2～3次，徹底勻漿，樣本管冰浴30 min，每間隔5min震蕩1次。12000r/min離心10min，收集上清液，即為總蛋白溶液。將蛋白溶液按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性15 min，放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]。

1.6.2.2 SDS-PAGE電泳 按照上述方法步驟配制5%的濃縮膠，最后將四甲基乙二胺(TEMED)加入，立即搖勻并迅速灌膠。電泳過程中發(fā)現(xiàn)溴酚藍析出即可終止電泳，開始進行轉膜工作。

1.6.2.3 轉膜 轉膜條件采用濕轉的方式，先快轉后慢轉，快轉采用300 mA恒流30 min，或者200 mA恒流1 h，時間長短可做略微調節(jié)，電流也做相應的調節(jié)。慢轉采用25 V的恒壓轉膜過夜。

1.6.2.4 免疫反應 用0.5%TBST和脫脂奶粉配置5%的脫脂牛奶，充分混勻。將轉好的膜放入脫脂牛奶中，在室溫條件下，放置于脫色搖床上，封閉1 h。將一抗用TBST溶解的5%脫脂牛奶進行稀釋，4 ℃條件下孵育抗體過夜。洗滌3次，每次5 min。將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫條件下，孵育30 min，之后再洗滌3次，每次5 min。

1.6.2.5 化學發(fā)光及凝膠圖像分析 用顯影和定影試劑對曝光后的膠片進行顯影和定影，用PhotoShop軟件對其整理去色，用Alpha軟件處理系統(tǒng)對目標帶的光密度值進行分析和處理。

2 結 果

2.1 PCR結果 與對照組相比，模型組HCN2 mRNA表達水平升高，在應用美托洛爾、青山健心片治療后HCN2 mRNA表達水平均降低，其中美托洛爾組HCN2 mRNA表達水平較青山健心片組降低明顯。詳見圖1。與對照組相比，模型組HCN4 mRNA表達水平升高，應用美托洛爾、青山健心片治療后HCN4 mRNA表達水平明顯降低，其中美托洛爾組較青山健心片組HCN4 mRNA表達水平降低明顯。詳見圖2。

圖1 各組HCN2 mRNA表達水平比較

圖2 各組HCN4 mRNA表達水平比較

2.2 Western-Blot結果 與對照組相比，模型組HCN2、HCN4蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。美托洛爾組、青山健心片組與模型組相比，HCN2、HCN4蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。青山健心片組HCN2、HCN4蛋白表達水平與美托洛爾組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2、圖3、圖4。

表2 各組大鼠心肌HCN2、HCN4蛋白表達水平比較 (±s)

圖3 各組HCN2蛋白表達灰度圖

圖4 各組HCN4蛋白表達灰度圖

3 討 論

If電流又稱為起搏電流，是公認的心臟自律活動的最重要離子流[11]。HCN有HCN1、HCN2、HCN3和HCN4 四種亞型，普通動物心室肌中主要表達HCN2，少量表達HCN4[12]。HCN2和HCN4在多種心臟疾病后的心室肌表達變化可能導致心室電重構，引起普通心室肌的電不穩(wěn)定性增加[13]，與各種心臟疾病的致死性并發(fā)癥室性心律失常關系密切。正常生理情況下，心室肌細胞中的HCN通道密度相對低，且激活閾值比正常靜息電位更負，因此，工作心肌細胞不產(chǎn)生If電流，但病理狀態(tài)下HCN的表達增加或者減少都會直接引起普通心肌細胞興奮性的改變[14]。

HCN在竇房結起搏電流節(jié)律和頻率調控及電流水平的維持方面起著重要的作用[15]，與If有著密切關系[16]，當HCN表達受抑制時If低；當表達上調時，If增大可誘發(fā)心律失常。

本研究發(fā)現(xiàn)陣發(fā)性心房顫動大鼠HCN2、HCN4蛋白及mRNA水平表達增加，說明HCN通道的表達及活性增加是心房顫動的重要原因。青山健心片和美托洛爾都具有降低HCN2、HCN4 mRNA及蛋白表達的作用。青山健心片對HCN2、HCN4蛋白及mRNA的過度表達均有抑制作用，推測青山健心片是通過下調HCN2、HCN4表達影響If電流，從而減少心房顫動發(fā)作。