孫 健 高 敏

1.北京農業(yè)職業(yè)學院牧醫(yī)系，北京102442；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100083

抗生素在防治仔豬早期斷奶綜合征、消化道疾病，保障動物健康方面發(fā)揮了重要作用[1-2]，但抗生素的不當使用破壞了動物腸道的微生態(tài)平衡，造成了病原菌耐藥和畜產品的獸藥殘留等問題，嚴重影響畜產品的品質和人類的健康[3]。尤其是近年來“限抗令”的頒布，尋找新的防治消化道疾病的方案已迫在眉睫?？咕淖鳛閯游餀C體天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗菌活性強、抗菌譜廣、無耐藥性、無殘留和毒性小等優(yōu)點[4-5]，在機體對抗感染及炎癥的過程中發(fā)揮了重要作用。防御素是抗菌肽家族的重要成員[6]，β 防御素是豬體內一類重要的內源性抗菌肽，是抵御病原微生物侵襲的一道重要防線[7]，在天然免疫中起著重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)所有防御素中β 防御素的分布區(qū)域最廣，大多數(shù)豬源β-防御素（porcine β-defensin，pBD）是良好的抗生素替代品，在豬消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等組織黏膜和上皮細胞中大量表達[8]，pBD1、pBD2、pBD3 是β-防御素家族中最為常見的3 種。

丁酸鈉（丁酸）在維持動物腸道健康、提高動物生產性能方面發(fā)揮了重要作用，2003年丁酸鈉被農業(yè)農村部列入《飼料添加劑品種目錄》，具有良好的應用前景。豬空腸上皮細胞（IPEC-J2）具有典型的豬小腸上皮細胞特性[7]。因此，本研究以豬空腸上皮細胞IPEC-J2 為模型，進行不同濃度的丁酸鈉對體外培養(yǎng)的IPEC-J2 的劑量依賴性刺激試驗，利用實時熒光定量PCR 從mRNA 水平分別研究不同濃度丁酸鈉刺激豬小腸上皮細胞后pBD1、pBD2、pBD3基因表達水平的差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗細胞株。豬小腸上皮細胞IPEC-J2，農業(yè)農村部飼料工業(yè)中心惠贈。

2）主要試劑。DEM/F12 培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司；epidermal growth factor，購自美國Peprotech公司；HEPES 緩沖液，購自美國sigma 公司；胎牛血清，購自美國Gibco 公司；Phosphate Buffered Saline 1X，購自美國Hyclone 公司；胰酶溶液，購自美國GIBCO 公司；二甲基亞砜，購自美國Sigma 公司；丁酸鈉，購自sigma 公司；RNA 提取試劑盒，購自北京天根生物科技公司；反轉錄試劑盒，購自Proteintech公司；熒光定量試劑盒購自北京康為世紀科技有限公司。

3）主要設備。二氧化碳培養(yǎng)箱（FORMA3110，美國Thermo）；超凈工作臺（SW-CJ-1FD，江蘇安泰空氣技術有限公司）；倒置顯微鏡（TS2，日本Nikon 公司）；PCR 儀（美國BIO-RAD）；熒光定量PCR 儀（Roche LC96，美國羅氏公司）；10 cm 細胞培養(yǎng)皿、12 孔培養(yǎng)板、0.22 μm 濾膜，均購自美國Corning 公司。

1.2 方 法

1）IPEC-J2 細胞培養(yǎng)與丁酸鈉添加。細胞培養(yǎng)基組成：DMEM/F12+10% FBS+1% insulin-transferrin-selenium+16 mmol/L HEPES+5 ng/mL epidermal growth factor。丁酸鈉添加方法：取相同數(shù)目細胞接種于六孔板中，5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)，至細胞鋪滿底層80%時用于試驗，吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗2～3 次，加入用無菌去離子水丁酸鈉溶液，使培養(yǎng)基內丁酸鈉的終濃度分別為（1、2、4、8、16、32 mmol/L），細胞培養(yǎng)24 h 后，添加含有丁酸鈉的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，提取RNA，定量，反轉錄得到cDNA，Q-PCR 進行檢測。

2）丁酸鈉刺激后細胞總RNA 的提取和反轉錄。RNA 提取按照試劑盒說明書操作。提取的樣品用1%瓊脂糖電泳觀察所提RNA 的質量，用Nano Drop 測A260nm和A280nm吸光度，以測定RNA 純度和濃度。將對照組與丁酸鈉處理組提取的總RNA，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，得到cDNA。以提取的總RNA 為模板，反轉錄合成cDNA 的體系為20 μL，反應條件為50 ℃15 min，85 ℃5 s。cDNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3）PCR 引物設計與合成。參照Gen-Bank 中所提供的基因序列設計特異性引物，內參為GAPDH。目的基因及內參基因引物由生工生物工程（北京）股份有限公司設計合成（表1）。

4）實時熒光定量PCR 檢測pBD1、pBD2、pBD3基因mRNA 表達水平。用熒光定量PCR 儀檢測在不同濃度丁酸鈉處理后pBD1、pBD2、pBD3其mRNA表達水平，對每個樣品cDNA 進行目的基因和內參基因熒光定量PCR 反應。20 μL 反應體系：Mix（2X）10 μL，Primer-F 1 μL，Primer-R 1 μL，cDNA 4 μL，ddH2O 4 μL。反應條件：進行PCR 擴增，95 ℃預變性；95 ℃10 min，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。PCR 擴增反應結束，根據(jù)擴增曲線的CT 值計算定量結果，并對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。目的基因及內參基因在同一條件下不同管內擴增，每個樣品設2 個重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

目的基因的相對表達量采用2△△CT法計算：△CT（目的基因）=CT（目的基因）－CT（內參基因）；△△CT＝△CT（丁酸鈉刺激組）－△CT（對照組）目的基因的相對表達水平＝2-△△CT。實時熒光定量PCR 結果均用“平均值±標準誤（Means±SE）”表示，其中各基因的表達量所示結果均經內參基因表達量的校正。采用GraphPad Prism 8 分析作圖，采用SPSS 15.0 的單因素ANOVA過程進行方差分析，以P＜0.05 為顯著性標準。

2 結果與分析

2.1 豬小腸上皮細胞總RNA 的檢測

所提取的Total RNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，RNA 樣品電泳條帶清晰。紫外分光光度計檢測樣品A260nm/A280nm，比值在1.8～2.0，表明無DNA殘留，無蛋白污染，可以滿足試驗要求。

2.2 不同濃度丁酸鈉對IPEC-J2 細胞pBD1 表達的影響

分別用不同濃度的丁酸鈉刺激豬小腸上皮細胞，24 h 后收集細胞，提取總RNA，反轉錄后QPCR 檢測pBD1、pBD2、pBD3mRNA 的表達。不同濃度丁酸鈉對pBD1表達的影響結果如圖1，可見1、2、4 mmol/L 丁酸鈉處理組，pBD1表達與對照組沒有顯著性差異。

2.3 不同濃度丁酸鈉對pBD2 表達的影響

不同濃度丁酸鈉對pBD2 表達的影響結果如圖2?？梢?、2、4 mmol/L 丁酸鈉處理組，pBD2 表達與對照組沒有顯著性差異。

表1 目的基因及內參基因引物序列

圖1 不同濃度丁酸鈉對pBD1 表達的影響

圖2 不同濃度丁酸鈉對pBD2 表達的影響

2.4 不同濃度丁酸鈉對pBD3 表達的影響

不同濃度的丁酸鈉對pBD3 表達的影響結果如圖3?？梢?、2、4 mmol/L 丁酸鈉處理組，pBD3 表達均顯著高于對照組，4 mmol/L 丁酸鈉處理組pBD3表達最高，丁酸鈉濃度與IPEC-J2 細胞pBD3 表達呈現(xiàn)正相關。

3 討 論

丁酸鈉制劑在調整胃腸道微生態(tài)平衡、預防腸道感染以及減輕胃腸道炎癥反應等方面發(fā)揮了重要作用，丁酸鈉作為腸道免疫調節(jié)劑和黏膜免疫佐劑，已廣泛用于畜禽飼料中以提高動物生產性能。從本次試驗結果來看，丁酸鈉對常見的pBD1、pBD2、pBD3 3 種豬源β 防御素的調控作用并不一致，丁酸鈉對pBD1、pBD2 調控作用不明顯。研究還表明丁酸鈉對IPEC-J2 細胞pBD3 的表達有調控作用，可以誘導防御素pBD3 的表達，而且調控作用與丁酸鈉的濃度有密切關系，在本試驗丁酸鈉設定的濃度范圍內呈正相關，這與Zeng 等[9]報道一致。另有研究表明，丁酸鹽能夠短時間內顯著提高A549細胞抗菌肽hBD-1 的表達[10]，且hBD-1 的表達量在丁酸鹽處理后的36～48 h 最高，但由于本試驗只進行了IPEC-J2 細胞丁酸鈉處理24 h 后檢測，未進行時間依賴性試驗，故不能給出結論。

圖3 不同濃度丁酸鈉對pBD3 表達的影響